วารสาร วารสาร

กรมวิ กรมวิททยาศาสตร์ ยาศาสตร์กการแพทย์ ารแพทย์ BULLETIN BULLETINOF OFTHE THEDEPARTMENT DEPARTMENTOF OFMEDICAL MEDICALSCIENCES SCIENCES ปีทปี่ี 64 ท่ี 64 ฉบัฉบั บทีบ่ 1ทีมกราคม ่ 1 มกราคม - มี-นมีาคม นาคม 2565 2565 Vol. Vol. 6464 No.No. 1 January 1 January - March - March 2022 2022

วิวิ จจ ัยัย และพั และพั ฒฒ นาเพื นาเพื ่อ่อ ดูดู แลสุ แลสุ ขข ภาพคนไทย ภาพคนไทย

https://bit.ly/BullDmsc https://bit.ly/BullDmsc

ว กรมวิทย พ 64 (1) ม.ค. - มี.ค. 2565 Bull Dept Med Sci 64 (1) January - March 2022

ครบรอบ ครบรอบ80 80ปีปีแห่ แห่งงคุคุณ ณภาพ ภาพ

วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

THE BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES

วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ จััดทำโดยกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กระทรวงสาธารณสุุข เพื่่�อเผยแพร่่ผลงาน วิิชาการด้้านวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ทุุกสาขา

The Bulletin of the Department of Medical Sciences is an official publication of the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health. It is devoted to the dissemination of knowledge concerning medical sciences and the facilitation of co-operation among scientists.

เจ้้าของ

กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กระทรวงสาธารณสุุข

Owner

Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health

ที่่�ปรึึกษาด้้านบริิหาร

นพ.ศุุภกิิจ ศิิริิลัักษณ์์ นพ.บััลลัังก์์ อุุปพงษ์์

นพ.พิิเชฐ บััญญััติิ นพ.ปิิยะ ศิิริิลัักษณ์์

Administrative Advisor

Supakit Sirilak Ballang Uppapong

Phichet Banyati Piya Sirilak

ที่่�ปรึึกษาด้้านวิิชาการ

นางพิิมพ์์ใจ นััยโกวิิท ดร.ปนััดดา ซิิลวา ดร.บุุษราวรรณ ศรีีวรรธนะ

ดร.สุุมล ปวิิตรานนท์์ ดร.เดืือนถนอม พรหมขััติิแก้้ว

Technical Advisor

Pimjai Naigowit Panadda Silva Busarawan Sriwanthana

Sumol Pavitranon Duanthanorm Promkhatkaew

บรรณาธิิการบริิหาร

ดร.ประไพ วงศ์์สิินคงมั่่�น

Executive Editor

Prapai Wongsinkongman

บรรณาธิิการ

ดร.อภิิวััฎ ธวััชสิิน

Editor

Apiwat Tawatsin

รองบรรณาธิิการ

นางสิิริิภากร แสงกิิจพร ดร.นวลจัันทร์์ วิิจัักษณ์์จิินดา

ดร.อุุรุุญากร จัันทร์์แสง

Assistant Editor

Siripakorn Sangkitporn Nuanjan Wichukchinda

Uruyakorn Chansang

คณะบรรณาธิิการ

ศ.เกีียรติิคุุณ ดร.พิิไลพัันธ์์ พุุธวััฒนะ ศ.ดร.นพ.ประเสริิฐ เอื้้�อวรากุุล ดร.ดนััย ทิิวาเวช ภญ.สุุวรรณา จารุุนุุช ศ.ดร.นพ.เผด็็จ สิิริิยะเสถีียร ศ.ดร.พรพิิมล กองทิิพย์์ รศ.ดร.ศรีีสุุรางค์์ ตัันติิมาวานิิช ดร.สุุณีี ศิิริิวิิชยกุุล รศ.ดร.ภญ.ชนิิตรา ธุุวจิิตต์์ รศ.ดร.ภญ.พิิณทิิพย์์ พงษ์์เพชร ดร.สลัักจิิต ชุุติิพงษ์์วิิเวท ดร.อุุษาวดีี ถาวระ นายสุุธน วงษ์์ชีีรีี นางวิิชชุุดา จริิยะพัันธุ์์� ดร.สุุภาณีี ดวงธีีรปรีีชา รศ.ดร.นวลฉวีี เวชประสิิทธิ์์� ดร.วัันทนา ปวีีณกิิตติิพร ดร.ปิิยะดา หวัังรุ่่�งทรััพย์์

มหาวิิทยาลััยมหิิดล มหาวิิทยาลััยมหิิดล มหาวิิทยาลััยนเรศวร มหาวิิทยาลััยหััวเฉีียวเฉลิิมพระเกีียรติิ จุุฬาลงกรณ์์มหาวิิทยาลััย มหาวิิทยาลััยมหิิดล มหาวิิทยาลััยมหิิดล จุุฬาลงกรณ์์มหาวิิทยาลััย มหาวิิทยาลััยมหิิดล นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

Editorial Board

Pilaipan Puthavathana Prasert Auewarakul Danai Tiwawech Suwanna Charunut Padet Siriyasatien Pornpimol Kongtip Srisurang Tantimavanich Sunee Sirivichayakul Chanitra Thuwajit Pintip Pongpech Salakchit Chutipongvivate Usavadee Thavara Suthon Vongsheree Wichuda Jariyapan Supanee Duangteraprecha Nuanchawee Wetprasit Wantana Paveenkittiporn Piyada Wangroongsarb

Mahidol University Mahidol University Naresuan University Huachiew Chalermprakiet University Chulalongkorn University Mahidol University Mahidol University Chulalongkorn University Mahidol University Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences

ฝ่่ายจััดการ

นางสาวน้้ำฝน น้้อยประเสริิฐ นางสาวประสาน จุุลวงษ์์ นางสาวอภิิมน จิิรพงศธร นายนาวีี ศรีีวรมย์์ นางสาวภาวิิณีี สุุขเจริิญ

กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

Administration

Numfon Noiprasert Prasan Julwong Aphimon Jiraphongsathorn Navy Srivarom Pawinee Sukcharoen

Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences

สำนัักงานวารสาร

กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ 88/7 ซอยติิวานนท์์ 14 ถนนติิวานนท์์ นนทบุุรีี 11000 โทร. 0-2951-0000  โทรสาร 0-2951-1297

Office

Department of Medical Sciences 88/7 Soi Tiwanond 14, Tiwanond  Rd., Nonthaburi 11000, Thailand. Tel. 0-2951-0000  Fax: 0-2951-1297

พิิมพ์์ที่่�

บริิษััท ธนอรุุณการพิิมพ์์ จำกััด 457/6-7 ถนนพระสุุเมรุุ แขวงบวรนิิเวศ เขตพระนคร กรุุงเทพฯ 10200 โทร. 0-2282-6033-4

Printed by

Thanaaroonkarnpim Co., Ltd. 457/6-7 Phra Sumen Road, Bangkok 10200 Tel. 0-2282-6033-4

วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์

BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES

ปีที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Vol. 64 No. 1 January - March 2022

สารบััญ หน้้า

นิิพนธ์์ต้้นฉบัับ การตรวจวิินิิจฉััยก่่อนคลอดสำหรัับกลุ่่�มอาการดาวน์์และโครโมโซมผิิดปกติิที่่�พบบ่่อย โดยวิิธีี Molecular Karyotyping สิิริิภากร แสงกิิจพร  ชเนนทร์์ วนาภิิรัักษ์์  อารีีรััตน์์ ขอไชย  ชลลดา ยอดทััพ สาวิิตรีี ด้้วงเรืือง

1

ณััชชา ปาณะจำนง พััชราภรณ์์ นพปรางค์์ อััจฉราพร ดำบััว พััชราภรณ์์ บุุญชูู และ สมชาย แสงกิิจพร

การตรวจวิินิิจฉััยการติิดเชื้้�อ HIV-1 จากตััวอย่่างหยดเลืือดแห้้งบนกระดาษซัับ โดยตรง ด้้วยวิิธีี real-time PCR วิิโรจน์์ พวงทัับทิิม รััชณีีกร ใจซื่่�อ  นวลจัันทร์์ วิิจัักษณ์์จิินดา  และ อาชวิินทร์์ โรจนวิิวััฒน์์

14

การพััฒนาระบบทดสอบสำหรัับคััดกรองสารยัับยั้้�งการทำงานของเอนไซม์์ไทโรซีีนไคเนส เพื่่�อค้้นหาสารต้้านมะเร็็ง ภาณุุพัันธ์์ ปััญญาใจ  ปฐมาพร ปรึึกษากร พัันธ์์ธิิดา ตรีียวง ฉััตรภรณ์์ ใจมา  และ ปนััดดา เทพอััคศร

25

การพััฒนาและทดสอบความใช้้ได้้ของวิิธีีวิิเคราะห์์สารฟิิโพรนิิลและเมตาโบไลต์์ ตกค้้างในไข่่และผลิิตภััณฑ์์ วีีรวุุฒิิ วิิทยานัันท์์  และ ธรณิิศวร์์ ไชยมงคล

48

บทความทั่่�วไป เว็็บไซต์์และแอปพลิิเคชัันการทดสอบความชำนาญห้้องปฏิิบััติิการของสำนัักยา และวััตถุุเสพติิด ศิิริิพร เหล่่ามานะเจริิญ  มาศวลััย ลิิขิิตธนเศรษฐ์์  และ อัังคณา กริิชพิิทัักษ์์เงิิน

67

วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์

BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES

ปีที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Vol. 64 No. 1 January - March 2022

CONTENTS Page

Original Articles Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders Using Molecular Karyotyping

1

Siripakorn Sangkitporn,  Chanane Wanapirak,  Areerat Khorchai, Chonlada Yodtup,  Sawitree Duangruang,  Natcha Panajamnong, Phatcharaphon Nopprang,  Acharaporn Dambua,  Patcharaporn Boonchu, and Somchai Sangkitporn

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Sample Using real-time PCR Wiroj Puangtabtim, Ratchaneekorn Jaisue, Nuanjun Wichukchinda,

14

Development of Tyrosine Kinase Inhibitor Screening Assay for Anti-cancer Agents Parnuphan Panyajai,  Patamaporn Pruksakorn,  Pantida Treeyoung,

25

Method Development and Validation for the Determination of Fipronil and Its Metabolite Residues in Eggs and Products Weerawut Wittayanan  and Thoranit Chaimongkol

48

and Archawin Rojanawiwat

Chattraporn Jaima,  and Panadda Dhepakson

Genernal Articles Proficiency Testing Website and Application of the Bureau of Drug and Narcotic Siriphorn Laomanacharoen,  Masvalai Likitthanasrate,  and Angkana Kritpitakngoen

67

บรรณาธิการแถลง วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ฉบัับที่่� 1 ปีีที่่� 64 พุุทธศัักราช 2565 ซึ่่�งอยู่่�ในช่่วงวัันคล้้ายวัันสถาปนา กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ครบรอบ 80 ปีี ในวัันที่่� 10 มีีนาคม 2565 ดัังนั้้�นจึึงได้้มีีการเปลี่่�ยนโลโก้้หน้้าปกของวารสาร กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์เพื่่�อเป็็นการเฉลิิมฉลองวาระสำคััญนี้้�ทั้้�ง 4 ฉบัับ ตลอดปีี 2565 นอกจากนี้้�ยัังได้้มีีการออกแบบ หน้้าปกให้้สอดคล้้องกัับวัันดาวน์์ซิินโดรมโลก (World Down Syndrome Day) ในวัันที่่� 21 มีีนาคม ของทุุกปีี ที่่ตั้้� ง� ขึ้้น� โดย Down Syndrome International หรืือ (DSI) ซึ่่ง� เป็็นองค์์กรที่่มีีจุ � ดป ุ ระสงค์์เพื่่อ� การพััฒนาชีีวิิตของผู้้�ที่เ่� ป็็น ดาวน์์ซิินโดรมซึ่่�งเกิิดจากการมีีโครโมโซมแท่่งที่่� 21 เกิินมาเป็็น 3 แท่่ง รวมทั้้�งส่่งเสริิมให้้เกิิดความเข้้าใจ การยอมรัับ และเกิิดความเท่่าเทีียมกัันในสัังคม นอกจากนี้้�ยัังได้้มีีการเปลี่่�ยนแปลงรููปแบบของการนำเสนอบทความในฉบัับแบบใหม่่ โดยการแบ่่งข้้อความเป็็นแบบหน้้าละ 2 คอลััมน์์ เพื่่�อทำให้้ผู้้�อ่่านสามารถอ่่านได้้ง่่ายสบายตามากขึ้้�นมากกว่่าแบบเดิิม หวัังว่่าผู้้�อ่่านคงสามารถสัังเกตเห็็นความแตกต่่างเหล่่านี้้�ได้้ ในฉบัับนี้้ยั� งั คงมีีเนื้้�อหาบทความวิิชาการที่่ใ� ห้้ความรู้้�และน่่าสนใจหลายเรื่่อ� ง ได้้แก่่ การตรวจวิินิจฉั ิ ยั ก่่อนคลอด สำหรัับกลุ่่�มอาการดาวน์์และโครโมโซมผิิดปกติิที่่�พบบ่่อยโดยวิิธีี Molecular Karyotyping การตรวจวิินิิจฉััยการติิดเชื้้�อ HIV-1 จากตััวอย่่างหยดเลืือดแห้้งบนกระดาษซัับโดยตรงด้้วยวิิธีี real-time PCR การพััฒนาระบบทดสอบสำหรัับ คััดกรองสารยัับยั้้�งการทำงานของเอนไซม์์ไทโรซีีนไคเนสเพื่่�อค้้นหาสารต้้านมะเร็็ง การพััฒนาและทดสอบความใช้้ได้้ของ วิิธีีวิเิ คราะห์์สารฟิิโพรนิิลและเมตาโบไลต์์ตกค้้างในไข่่และผลิิตภััณฑ์์ และ เว็็บไซต์์และแอปพลิิเคชัันการทดสอบความชำนาญ ทางห้้องปฏิิบััติิการของสำนัักยาและวััตถุุเสพติิด กองบรรณาธิิการวารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ ขอขอบคุุณผู้้�นิิพนธ์์ทุุกท่่านที่่�ส่่งบทความมาให้้พิิจารณา ตีีพิิมพ์์เผยแพร่่องค์์ความรู้้�และงานวิิจััย ซึ่่�งจะเป็็นประโยชน์์ต่่อการปฏิิบััติิงานด้้านการพััฒนาวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ และสาธารณสุุขของประเทศ ขอขอบพระคุุณผู้ท้� รงคุุณวุุฒิทุิ กุ ท่่านในการพิิจารณาบทความ (peer review) ที่่ใ� ห้้ข้อ้ เสนอแนะ ในการปรัับปรุงุ แก้้ไขบทความวิิจัยั ต่่างๆ ให้้มีีความถููกต้้องทางวิิชาการและอ่่านได้้เข้้าใจง่่ายขึ้้น� และขอขอบพระคุุณทุุกท่่าน ที่่มีีส่่ � วนในการจััดทำวารสารฉบัับนี้้ใ� ห้้เสร็็จสมบููรณ์์ด้ว้ ยดีี กองบรรณาธิิการหวัังเป็็นอย่่างยิ่่ง� ว่่าวารสารฉบัับนี้้จ� ะเป็็นประโยชน์์ สำหรัับผู้้�อ่่านทุุกท่่านในการเสริิมสร้้างองค์์ความรู้้�ทางด้้านวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์และสาธารณสุุข และโปรดติิดตามความรู้้� และงานวิิจััยจากวารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ฉบัับต่่อไป ซึ่่�งจะเผยแพร่่ภายในเดืือนมิิถุุนายน 2565



ดร.อภิิวััฏ ธวััชสิิน บรรณาธิิการวารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

ค�ำแนะน�ำส�ำหรับผู้นิพนธ์ วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์รบั ตีพมิ พ์เผยแพร่บทความ เพือ่ สนับสนุนและส่งเสริมการสร้าง องค์ความรู้ใหม่ด้านวิทยาศาสตร์การแพทย์ที่เกี่ยวกับชีววัตถุ เครื่องมือแพทย์ เครื่องส�ำอาง ยาที่เป็นเภสัช เคมีภัณฑ์ อาหารและเครื่องดื่ม สมุนไพร ยาเสพติด วัตถุอันตราย รังสี โรคติดต่อ โรคไม่ติดต่อ พาหะน�ำโรค การประเมินความเสีย่ ง การวิจยั ทางคลินกิ ระบบบริหารจัดการคุณภาพ และอืน่ ๆ โดยก�ำหนดตีพมิ พ์วารสาร ปีละ 4 ฉบับ เป็นรายไตรมาส ได้แก่ 1) ฉบับเดือนมกราคม-มีนาคม 2) ฉบับเดือนเมษายน-มิถุนายน 3) ฉบับเดือนกรกฎาคม-กันยายน และ 4) ฉบับเดือนตุลาคม-ธันวาคม วารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ เริม่ เผยแพร่ทางระบบออนไลน์เท่านัน้ ตัง้ แต่ฉบับเดือนตุลาคมธันวาคม 2562 เป็นต้นไป

ประเภทของบทความ บทความสามารถเขียนได้ทั้งภาษาไทยและภาษาอังกฤษ โดยแบ่งบทความออกเป็นประเภทต่างๆ ดังนี้

1. นิพนธ์ต้นฉบับ เป็นรายงานผลการศึกษาวิจัย พัฒนาเทคโนโลยี หรือพัฒนาระบบคุณภาพห้องปฏิบัติการที่ มีการวางรูปแบบ และด�ำเนินการศึกษาวิจัยพัฒนาตลอดจนวิเคราะห์ข้อมูลอย่างถูกต้องตามหลักวิชาการ ประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ ชื่อผู้นิพนธ์พร้อมสังกัด บทคัดย่อ ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ วัสดุและวิธีการ ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสารอ้างอิง ความยาวทั้งหมดไม่เกิน 25 หน้าขนาดกระดาษ A4

2. รายงานจากห้องปฏิบัติการ เป็นรายงานผลการตรวจวิเคราะห์ทางห้องปฏิบัติการที่มีผู้น�ำตัวอย่างมาส่งตรวจ หรือรายงานผล การด�ำเนินงานที่เป็นงานประจ�ำ ประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ ชื่อผู้นิพนธ์พร้อมสังกัด บทคัดย่อ ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ วัสดุและวิธีการ ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสารอ้างอิง ความยาวทั้งหมด ไม่เกิน 25 หน้าขนาดกระดาษ A4

3. บทความปริทัศน์ เป็นบทความที่ได้จากการทบทวนหรือรวบรวมความรู้วิชาการเรื่องใดเรื่องหนึ่งจากต�ำรา วารสาร วิชาการ หรือหนังสือต่าง ๆ ทัง้ ในและต่างประเทศ น�ำมาวิเคราะห์ วิจารณ์ หรือเปรียบเทียบ เพือ่ ให้ได้บทความใหม่ ที่มีความเห็นของผู้นิพนธ์และท�ำให้เกิดความชัดเจนในเรื่องนั้น ประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ

ชือ่ ผูน้ พิ นธ์พร้อมสังกัด บทคัดย่อ ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ วิธกี ารสืบค้นข้อมูล เนือ้ หา วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสารอ้างอิง ความยาวทั้งหมดไม่เกิน 20 หน้าขนาดกระดาษ A4

4. บทความทั่วไป เป็นบทความทางวิทยาศาสตร์ที่เกี่ยวกับการพัฒนาระบบงานด้านการแพทย์และสาธารณสุข เช่น รายงานการพัฒนาระบบสนับสนุนการปฏิบัติงาน การพัฒนาระบบเทคโนโลยีสารสนเทศ หรือการพัฒนา ระบบบริหารจัดการคุณภาพตามมาตรฐานสากล เป็นต้น ประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ ชื่อผู้นิพนธ์ พร้อมสังกัด บทคัดย่อ ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ วัสดุและวิธีการ ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสาร อ้างอิง ความยาวทั้งหมดไม่เกิน 15 หน้าขนาดกระดาษ A4

5. บทความพิเศษ เป็นบทความทีเ่ ป็นความรูห้ รือข้อคิดเห็นทัว่ ไป เกีย่ วกับสถานการณ์ปจั จุบนั ทีน่ า่ สนใจทางการแพทย์ และสาธารณสุขในระดับประเทศหรือระดับนานาชาติ เพือ่ น�ำไปประยุกต์ใช้ในภารกิจทีเ่ กีย่ วข้องประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ ชื่อผู้นิพนธ์พร้อมสังกัด บทคัดย่อ ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ เนื้อหา วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสารอ้างอิง ความยาวทั้งหมดไม่เกิน 15 หน้าขนาดกระดาษ A4

6. กรณีศึกษา เป็นรายงานเกีย่ วกับการสอบสวนโรคในกลุม่ ตัวอย่างขนาดเล็ก หรือการวินจิ ฉัยผูป้ ว่ ยรายทีน่ า่ สนใจ ทีม่ กี ารตรวจทางห้องปฏิบตั กิ ารร่วมด้วย ทีอ่ าจอยูภ่ ายใต้ตวั แปรทีค่ วบคุมได้ หรือสภาพแวดล้อมทีไ่ ม่สามารถ ควบคุมได้ ประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ ชื่อผู้นิพนธ์พร้อมสังกัด บทคัดย่อ ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ วัสดุ และวิธีการ ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสารอ้างอิง ความยาวทั้งหมดไม่เกิน 10 หน้า ขนาดกระดาษ A4

7. จดหมายถึงบรรณาธิการ เป็นบทความที่ผู้อ่านวารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์เขียนถึงบรรณาธิการหรือเจ้าของบทความ ที่ตีพิมพ์ในวารสารฯ แล้ว ทั้งนี้เพื่อเสนอแนะหรือแสดงข้อคิดเห็นเกี่ยวกับวารสารฯ หรือบทความนั้น ๆ

8. บทความวิจัยอย่างสั้น เป็นรายงานวิจัยที่ด�ำเนินการแล้วเสร็จซึ่งมีประเด็นการศึกษาไม่มาก แต่มีรายละเอียดครบถ้วน ตามหลักเกณฑ์ของงานวิจัย หรือเป็นรายงานการศึกษาวิจัยอย่างย่อโดยอาจเป็นข้อมูลที่ศึกษาเพิ่มเติมจาก รายงานการศึกษาวิจัยที่ได้เคยตีพิมพ์แล้ว หรืออาจเป็นการรายงานผลการศึกษาบางส่วนที่อยู่ในความสนใจ

ของสาธารณะหรือตอบปัญหาที่เกิดขึ้นในขณะนั้น ประกอบด้วย ชื่อเรื่อง ชื่อเรื่องโดยย่อ ชื่อผู้นิพนธ์ พร้อมสังกัด บทคัดย่อ (ไม่เกิน 100 ค�ำ) ค�ำส�ำคัญ บทน�ำ (อย่างย่อ) วัสดุและวิธีการ (โดยย่อ) ผล วิจารณ์ สรุป กิตติกรรมประกาศ และเอกสารอ้างอิง ความยาวทั้งหมดไม่เกิน 10 หน้าขนาดกระดาษ A4 ทั้งนี้ตาราง และ/หรือภาพรวมกันมีจ�ำนวนทั้งหมดไม่เกิน 2 ตาราง/ภาพ

การพิจารณาบทความ บทความทุกเรื่องที่ผู้นิพนธ์เสนอขอรับตีพิมพ์ต้องไม่เคยตีพิมพ์ หรือก�ำลังตีพิมพ์ในวารสารอื่น คณะบรรณาธิการทีไ่ ด้รบั มอบหมายจะตรวจสอบความสมบูรณ์ของบทความในเบือ้ งต้น ก่อนส่งพิจารณาตรวจ แก้แบบไม่เปิดเผยตัวตน (double-blinded peer review) จากผู้เชี่ยวชาญในสาขาที่เกี่ยวข้อง อย่างน้อย 2 คน โดยบรรณาธิการเป็นผู้พิจารณาคัดเลือกผู้เชี่ยวชาญ และหากจ�ำเป็นอาจคัดเลือกผู้เชี่ยวชาญคนที่ 3 พิจารณาทบทวนบทความเพิม่ เติม บรรณาธิการหรือรองบรรณาธิการเป็นผูพ้ จิ ารณาค�ำแนะน�ำของผูเ้ ชีย่ วชาญ ทั้งหมด และแจ้งผลการพิจารณาแก่ผู้นิพนธ์ หลังจากผู้นิพนธ์แก้ไขอาจส่งให้ผู้เชี่ยวชาญพิจารณาตรวจสอบ อีกครัง้ โดยบรรณาธิการเป็นผูต้ รวจสอบบทความขัน้ สุดท้ายก่อนส่งตีพมิ พ์ ซึง่ กองบรรณาธิการ ขอสงวนสิทธิ์ ในการตรวจแก้ไขต้นฉบับและพิจารณาตีพิมพ์ตามล�ำดับก่อนหลัง

ความรับผิดชอบ บทความที่ตีพิมพ์ในวารสารกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ ถือเป็นผลงานทางวิชาการ และเป็น ความเห็นส่วนตัวของผูน้ พิ นธ์ ไม่ใช่ความเห็นของกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ หรือกองบรรณาธิการ ผูน้ พิ นธ์ ต้องรับผิดชอบต่อบทความของตน

จริยธรรมการวิจัย กรณีบทความเป็นผลการศึกษาวิจัยในมนุษย์หรือใช้ตัวอย่างใด ๆ จากมนุษย์ การวิจัยนั้น ๆ ต้อง ผ่านการพิจารณาอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในมนุษย์ของหน่วยงาน และกรณีที่เป็นผล การศึกษาวิจัยที่ใช้สัตว์ทดลอง การวิจัยนั้น ๆ ต้องผ่านการพิจารณาอนุมัติจากคณะกรรมการการเลี้ยงและ ใช้สัตว์เพื่องานทางวิทยาศาสตร์ของหน่วยงานเช่นกัน ถ้าหากไม่มี ต้องชี้แจงด้วย

การเตรียมต้นฉบับ ภาษาที่ใช้คือ ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ ต้นฉบับภาษาไทย ควรใช้ภาษาไทยให้มากที่สุด ค�ำศัพท์ เฉพาะหรือค�ำศัพท์ภาษาอังกฤษที่บัญญัติเป็นภาษาไทยแล้ว แต่ยังไม่เป็นที่ทราบกันอย่างแพร่หลาย หรือแปลแล้วเข้าใจยาก ให้ใส่ภาษาอังกฤษก�ำกับไว้ในวงเล็บ หรืออนุโลมให้ใช้ภาษาอังกฤษได้

ต้นฉบับพิมพ์ดว้ ยโปรแกรม Microsoft Word for Windows เท่านัน้ และต้องไม่มี File protection ตั้้�งค่่ากระดาษขนาด A4 ใช้้ตััวอัักษร TH Sarabun PSK ขนาด 16 ใส่่เลขกำกัับทุุกหน้้าและทุุกบรรทััด โดย หน้้าที่่� 1 ประกอบด้้วย ชื่่�อเรื่่�อง ชื่่�อและนามสกุุลของผู้้�นิิพนธ์์ทั้้�งหมด หน่่วยงานสัังกััดของคณะผู้้�นิิพนธ์์ ชื่่�อ เรื่่�องโดยย่่อ (Running title) และชื่่�อพร้้อมอีีเมล์์ผู้้�ประสานงาน (Corresponding author) กัับคณะ บรรณาธิิการ หน้้าที่่� 2 และ 3 เป็็นบทคััดย่่อภาษาไทยและภาษาอัังกฤษ ตามลำดัับ ความยาวไม่่เกิิน 300 คำ และระบุค�ำส�ำคัญท้ายบทคัดย่อ 1. ชื่อเรื่องและชื่อเรื่องโดยย่อ มีทั้งภาษาไทยและภาษาอังกฤษที่ชัดเจนและตรงกับประเด็นการศึกษา ไม่ใช้ค�ำย่อ 2. ชือ่ ผูน้ พิ นธ์และผูร้ ว่ มนิพนธ์ ระบุชอื่ และนามสกุลเต็มทัง้ ภาษาไทยและภาษาอังกฤษ ไม่ตอ้ งระบุตำ� แหน่ง และค�ำน�ำหน้าชื่อ 3. ชือ่ สังกัด/สถานทีป่ ฏิบตั งิ าน มีทงั้ ภาษาไทยและภาษาอังกฤษของหน่วยงานทีผ่ นู้ พิ นธ์สงั กัด/ปฏิบตั งิ าน หากมีผู้นิพนธ์หลายรายและอยู่คนละสังกัด ให้ก�ำกับด้วยตัวเลขเป็นตัวยก 4. บทคััดย่่อ ต้้องเขีียนทั้้�งภาษาไทยและภาษาอัังกฤษ ความยาวไม่่เกิิน 300 คำ เนื้้�อหาครอบคลุุมที่่�มา ของการศึกษา วัตถุประสงค์ ขอบเขตการศึกษา วิธีท�ำหรือวิธีการรวบรวมข้อมูลที่ส�ำคัญโดยย่อ แสดง ผลการศึกษาเฉพาะข้อมูลหลักทีส่ ำ� คัญและสถิตทิ ใี่ ช้ (ถ้าจ�ำเป็น) รวมถึงหลักการหรือองค์ความรู้สำ� คัญ ที่พบใหม่ 5. ค�ำส�ำคัญ ระบุค�ำส�ำคัญทั้งภาษาไทยและภาษาอังกฤษไม่เกิน 5 ค�ำ 6. บทน�ำ ควรกล่าวถึงหลักการเหตุผล ปัญหาหรือสมมุติฐาน ที่น�ำไปสู่ความจ�ำเป็นที่ต้องศึกษา รวมทั้ง วัตถุประสงค์ของการศึกษา การอ้างอิงควรเลือกใช้เฉพาะเอกสารอ้างอิงที่ส�ำคัญและเป็นปัจจุบัน 7. วัสดุและวิธีการ แสดงรายละเอียดทางวิชาการเป็นเชิงพรรณนาที่มากพอเพื่อผู้อ่านที่สนใจสามารถ ท�ำงานนี้ซ�้ำได้ เช่น กลุ่มตัวอย่างหรือข้อมูลที่ศึกษาวิธีสุ่มเก็บตัวอย่างหรือข้อมูล วิธีวิเคราะห์ตัวอย่าง หรือข้อมูล วิธีการค�ำนวณหรือวิเคราะห์ข้อมูล และสถิติที่ใช้ เป็นต้น ให้ระบุบริษัทและประเทศผู้ผลิต ของน�้ำยา สารเคมี เครื่องมือรวมถึงรุ่นของเครื่องมือ หรือสายพันธุ์ของจุลชีพในส่วนที่เกี่ยวข้อง โดยละเอียด ทั้งนี้ บทความการศึกษาในมนุษย์หรือใช้ตัวอย่างจากมนุษย์ หรือการศึกษาที่ใช้สัตว์ทดลองให้ ระบุชื่อคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยในมนุษย์ หรือคณะกรรมการการเลี้ยงและใช้สัตว์เพื่องาน ทางวิทยาศาสตร์ที่อนุมัติให้ท�ำการศึกษา และหมายเลขอ้างอิงที่ได้รับอนุมัติ 8. ผล น�ำเสนอผลงานตามล�ำดับ หลีกเลี่ยงการใช้กราฟหรือภาพที่ไม่จ�ำเป็น ถ้ามีตารางข้อมูล กราฟ หรือ ภาพให้เสนอพร้อมกับค�ำอธิบายที่มีเนื้อหาชัดเจนครบถ้วน และให้แยกออกจากเนื้อเรื่อง หน้าละ 1 รายการ โดยไม่ต้องใส่กรอบตารางหรือภาพที่ต้องการแสดง ภาพถ่าย (สีหรือขาวด�ำ) ที่มีความชัดเจน ให้บนั ทึกภาพโดยใช้นามสกุล .jpg หากเป็นภาพวาดควรวาดบนกระดาษขาวอย่างดีดว้ ยหมึกด�ำลายเส้น คมและชัดเจน ระบุต�ำแหน่งที่ต้องการแสดงตารางหรือภาพไว้ในส่วนของเนื้อเรื่อง

9. วิจารณ์ วิจารณ์สิ่งที่ค้นพบและควรเปรียบเทียบกับงานที่ผู้อื่นท�ำและเผยแพร่ไว้ก่อนหน้านี้แล้ว หรือ วิเคราะห์และสรุปเปรียบเทียบกับสมมติฐานทีว่ างไว้ ว่าตรงหรือแตกต่างไปหรือไม่ อย่างไร เพราะเหตุใด ทั้งนี้ควรระวังไม่น�ำส่วนของผลมากล่าวซ�้ำในส่วนนี้ หากจ�ำเป็นต้องกล่าวถึงควรเขียนผลในภาพรวม ทีส่ ำ� คัญ และอาจเขียนถึงผลกระทบตามหลักวิชาการทีอ่ าจเกิดขึน้ หรือการน�ำไปใช้ประโยชน์จากผลการ ศึกษาวิจัยนี้ 10. สรุป เน้นสิ่งที่พบใหม่ที่ส�ำคัญจากการศึกษานี้ และเชื่อมโยงการสรุปกับวัตถุประสงค์ ควรอภิปราย ข้อจ�ำกัด/ข้อบกพร่อง ข้อดีเด่น ซึง่ น�ำไปสูข่ อ้ เสนอแนะในเชิงนโยบาย ในทางการปฏิบตั ิ และในการวิจยั ต่อไป 11. กิตติกรรมประกาศ ระบุผู้สนับสนุน และ/หรือแหล่งทุนสนับสนุนการวิจัย 12. เอกสารอ้างอิง การอ้างเอกสารในเนื้อเรื่องให้ใช้รูปแบบการอ้างอิงในแวนคูเวอร์ (Vancouver Citation Style) โดยใส่ตัวเลขตัวยก ในวงเล็บ วางไว้หลังข้อความหรือหลังชื่อบุคคล การเรียงล�ำดับ เอกสารอ้างอิงเริ่มจาก “(1)” และเรียงเลขอื่น ๆ ต่อไปตามล�ำดับการอ้างอิงของเนื้อหา ส่วนเอกสาร อ้างอิงท้ายเรือ่ งให้อา้ งเฉพาะบทความทีต่ พี มิ พ์แล้วในสิง่ ตีพมิ พ์ปฐมภูมเิ ท่านัน้ ผูน้ พิ นธ์ตอ้ งรับผิดชอบ ในความถูกต้องของเอกสารอ้างอิง

การเขียนเอกสารอ้างอิง การเขียนเอกสารอ้างอิงให้ใช้รูปแบบดังตัวอย่าง ผู้นิพนธ์ตั้งแต่ 1 ถึง 6 คน ให้ใส่ชื่อทุกคน ถ้ามี มากกว่า 6 คนให้ใส่ชอื่ 6 คนแรกตามด้วย และคณะ หรือ et al กรณีบทความไม่มชี อื่ ผูน้ พิ นธ์ให้ใช้ชอื่ เอกสาร แทนชื่อผู้นิพนธ์

1. การอ้างบทความวารสาร (Article in Journal) วารสารภาษาไทย ตัวอย่าง สุภาวรรณ จงธรรมวัฒน์, บ�ำรุง คงดี, วิชยั ประสาททอง, มณี เขม้นเขตรการ, จิราภรณ์ อ�ำ่ พันธุ,์ กมล ฝอยหิรญ ั และคณะ. การส�ำรวจคุณภาพถุงยางอนามัยทัว่ ประเทศ. ว กรมวิทย พ 2540; 39(2): 67-74.

วารสารภาษาอังกฤษ ตัวอย่าง Belshe RB, Coelingh K, Ambrose CS, Woo JC, Wu X. Efficacy of live attenuated influenza vaccine in children against influenza B viruses by lineage and antigenic similarity. Vaccine 2010; 28(9): 2149-56.

2. การอ้างหนังสือหรือต�ำรา (Text/Guideline) ตัวอย่าง ธีระพร วุฒยวนิช, บรรณาธิการ. เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์. เชียงใหม่: คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยเชียงใหม่; 2546. Greenberg AE, Clescri LS, Eaton AD, editors. Standard methods for the examination off water and wastewater. 18th ed. Washington DC: American Public Health Association; 1992. p. 9-94.

3. การอ้างเฉพาะบทในต�ำรา (Chapter in the text) ตัวอย่าง ทวีศักดิ์ แทนวันดี. การวินิจฉัยโรคตับจากไวรัสทางคลินิก. ใน: สิริฤกษ์ ทรงศิวิไล, บรรณาธิการ. ตับอักเสบจากไวรัส เล่ม 1. กรุงเทพฯ: บางกอกบล๊อก; 2543. หน้า 281-309. Phillips SJ, Whisnant JP. Hypertension and stroke. In: Laragh JH, Brenner BM, editors. Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. 2nd ed. New York: Raven Press; 1995. p. 465-78.

4. การอ้างกฎหมาย (Legal material) ตัวอย่าง พระราชบัญญัติอาหาร พ.ศ. 2522 ประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 61 (พ.ศ. 2524) ราชกิจจานุเบกษา เล่ม 98 ตอนที่ 157 (วันที่ 7 กันยายน 2524). Preventive Health Amendments of 1993, Pub L No. 103-183, 107 Stat. 2226 (1993 Dec 14)

5. การอ้างสิง่ พิมพ์ขององค์กรหรือหน่วยงาน (Organization as author and publisher) ตัวอย่าง กรมสนับสนุนบริการสุขภาพ กระทรวงสาธารณสุข. แผนยุทธศาสตร์การด�ำเนินงานสุขภาพ ภาคประชาชน. พิมพ์ครั้งที่ 2. กรุงเทพฯ: ชุมนุมสหกรณ์การเกษตรแห่งประเทศไทย; 2546. Department of Medical Sciences. Guideline of method validation used in pharmaceutical analysis. Nonthaburi: Department of Medical Sciences; 1995. Lamasil [package insert]. East Hanover (NJ): Sandoz Pharmaceuticals Corp; 1993.

6. การอ้างรายงานการสัมมนา/ประชุมวิชาการ (Conference paper/Conference Proceeding) ตัวอย่าง วิยะดา เจริญศิริวัฒน์. เอกสารการประชุมสัมมนาเฉลิมพระเกียรติเรื่อง การคัดกรองภาวะพร่อง ไทรอยด์ฮอร์โมนในทารกแรกเกิดเพื่อป้องกันปัญญาอ่อน. วันที่ 25 พฤศจิกายน 2542. นนทบุรี: กรม วิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข; 2542. Bengtsson S, Solheim BG. Enforcement of data protection, privacy and security in medical informatics. In: Lun KC, Degoulet P, Piemme TE, Rienhoff O, editors. MEDINFO 92. Proceedings of the 7th World Congress on Medical Informatics; 1992 Sep 6-10; Geneva, Switzerland. Amsterdam: North-Holland; 1992. p. 1561-5.

7. การอ้างวิทยานิพนธ์ (Dissertation) ตัวอย่าง มณี เขม้นเขตรการ. ผลของ N-acetylcysteine ต่อการป้องกันพิษของพาราควอทในหนูขาว [วิทยานิพนธ์]. ภาควิชาพิษวิทยา, คณะวิทยาศาสตร์. เชียงใหม่: มหาวิทยาลัยเชียงใหม่; 2547. Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly’s access and utilization [dissertation]. St. Louis, (MO): Washington University; 1995.

8. การอ้างสื่ออิเล็กทรอนิกส์ (Electronic material) วารสารออนไลน์ (Journal on Internet) ตัวอย่าง ชวนพิ ศ ยิ้ ม สมบั ติ . การประเมิ น คุ ณ ภาพการตรวจหาเชื้ อ มาลาเรี ย บนฟิ ล ์ ม โลหิ ต บางด้ ว ย กล้องจุลทรรศน์. ว กรมวิทย์ พ [วารสารออนไลน์]. 2548; [สืบค้น 29 ก.ย. 2548]; 47(2): [8 หน้า]. เข้าถึงได้จาก: URL: http://www.dmsc.moph.go.th/net/jms/. Morse SS. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg Infect Dis [serial online] 1995. Jan-Mar [cited 1996 Jun 5]; 1(1): [24 screens]. Available from: URL: http://www.cdc.gov/ncidod/EID/eid.htm.

เว็บไซต์ (Website) ตัวอย่าง กรมควบคุมโรค. การป้องกันควบคุมโรคไข้หวัดนก Avian Influenza (Bird Flu). [ออนไลน์]. 2548; [สืบค้น 28 ก.ย. 2548]; [1 หน้า]. เข้าถึงได้ท:ี่ URL: http://www.ddc.moph.go.th/Bird_Flu_ main.html.

Hoffiman DL. St John’s Wort. [online]. [cited 1998 Jul 16]; [4 screens]. Available from: URL: http://www.healthy.net/library/books/hoffiman/materiamedica/stjohns.htm.

การส่งต้นฉบับและการตอบรับบทความทางออนไลน์ ส่งต้นฉบับไฟล์บทความ ตาราง ภาพ และหนังสือน�ำส่ง ผ่านทางระบบออนไลน์ได้ทาง http://webapp1. dmsc.moph.go.th/journals ทัง้ นีผ้ นู้ พิ นธ์จะต้องสมัครเข้าเป็นสมาชิกในระบบก่อนด�ำเนินการส่งต้นฉบับ และจะได้รับการตอบรับอัตโนมัติเมื่อเสร็จสิ้นกระบวนการ คณะบรรณาธิการจะแจ้งผูป้ ระสานงาน (Corresponding author) ทราบทางอีเมล์ถงึ การตอบรับ หรือปฏิเสธการตีพิมพ์บทความ

การตรวจทานต้นฉบับก่อนเผยแพร่ ผู้นิพนธ์ต้องตรวจพิสูจน์อักษรในล�ำดับสุดท้าย เพื่อให้ความเห็นชอบในความถูกต้องครบถ้วนของ เนื้อหา ปรับปรุง วันที่ 16 สิงหาคม 2562

INSTRUCTIONS FOR AUTHORS The Bulletin of the Department of Medical Sciences welcomes the medical sciences articles in the areas of biological products, medical devices, cosmetics, pharmaceutical products, food and beverage, medicinal plants, narcotic drugs, hazardous substances, radiation, communicable diseases, non-communicable diseases, vectors of diseases, risk assessment, clinical researches, quality management systems, etc. The Bulletin is quarterly published: 1) January-March, 2) April-June, 3) July-September, and 4) October-December. The manuscripts can be submitted in either Thai or English. The Bulletin of the Department of Medical Sciences will be published online-only from the issue of October-December 2019 onwards.

Types of journal manuscripts 1. Original article

Original article is the report of a study, technology development, or laboratory quality system development describing research question, details of methods as well as interpretation of results with discussion of possible implications. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract, keywords, introduction, materials and methods, results, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 25 pages of A4 paper.

2. Laboratory findings

Laboratory findings are the report of the results of laboratory examinations. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract, keywords, introduction, materials and methods, results, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 25 pages of A4 paper.

3. Review article

Review article is an article that summarizes the previously published studies as well as the current state of understanding on certain topics aiming to analyze or compare the concepts and introduce some clear perspectives on that matter. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract, keywords, introduction, how to review, content, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 20 pages of A4 paper.

4. General article

General article is a scientific report related to medical and public health system development such as operation support, information technology, quality management, etc. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract, keywords, introduction, materials and methods, results, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 15 pages of A4 paper.

5. Special article

Special article is a small article which cannot be categorized to types of articles mentioned above. It can be the author’s opinions on any current or up-to-date issues. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract, keywords, introduction, content, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 15 pages of A4 paper.

6. Case study

Case study is a report of study involving particular group or situation over a period of time in order to illustrate a principle. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract, keywords, introduction, materials and methods, results, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 10 pages of A4 paper.

7. Letter to the editor

Letter to the editor is correspondences from readers to the editor or the authors providing different opinions or suggestions of recently published articles.

8. Short communications

Short communications are short papers that present original and significant material for rapid dissemination. The manuscript should contain a title, a running title, the authors’ names with affiliations, an abstract (limited to 100 words), keywords, introduction, materials and methods, results, discussion, conclusion, acknowledgements and references. The total length should not exceed 10 pages of A4 paper with no more than 2 figures or tables, combined.

Publication process

Each article will be initially reviewed by the Editor and sent to at least 2 selected experts. The identities of both reviewers and authors throughout the review are concealed (double-blinded peer review). Comments from the experts will be considered by the Editor and sent to the author for revision. In some cases, more comments from the third expert is necessary. The editorial board reserves the right to edit any manuscripts for proper publication. The Editor will review the final draft of each article.

Responsibility

Articles published in this Bulletin represent the research activities or opinions of the authors, not the opinion of the editorial board or Department of Medical Sciences. The authors are responsible for its contents.

Research ethics

The clinical research and research involve human specimens must be approved by the Institutional Ethics Committee. The research that involves animals must be approved by the Institutional Animal Care and Use Committee.

Preparation of manuscripts

Both Thai and English manuscripts are acceptable. For Thai manuscript, the author should translate the English vocabulary to Thai as much as possible. In case of no official Thai words, having an English word in the parentheses is preferred. Manuscripts shall be prepared with Microsoft Word for Windows without file protection using 16-pt TH Sarabun PSK. Line numbers should be added on every page. The first page shall carry the title of the article, full names of authors with affiliations, a running title and corresponding author’s email address. The second and third page shall carry an abstract both in Thai and English of no more than 250 words. Key words should be added after the abstract. The structure of original articles and laboratory findings should be in the order as following: 1. Title (and running title): The title should be short and represent the focus of the study and should not use abbreviations. 2. Authors: The full name of each author and email address of corresponding author should be submitted. 3. Organization: The organizational affiliation of each author should be in numerical order.

4. Abstract: The abstract should be written in both Thai and English, not exceed 250 words, and it should consist of rationales, objectives, methodology, and body of knowledge. 5. Keywords: Maximum of 5 keywords in both Thai (effective from the volume of October-December 2019 onwards) and English should be provided. 6. Introduction: The introduction should provide the hypothesis or the rationale for the study as well as the objective(s) of the study. Give only pertinent references. 7. Materials and Methods: Give the full technical information so that the experiments can be repeated such as group of sample/study, sampling methodology, analysis methodology, statistical analysis, if used, etc. The sources of all materials and apparatus or strains of microorganisms must be provided if they have the potential impact to the study results. For the clinical research, or research involves human specimens or animals, name of the ethics committee(s) or institutional review board(s) as well as the number/ID of the approval(s) must be stated. 8. Results: Present the results as concisely as possible in logical sequence. Avoid unnecessary graphs and figures. The tabular data, graphs, or figures, if needed, should be provided with clear description. Each table or figure should be prepared and described on a separate file. An electronic image should be prepared as .jpg file. 9. Discussion: Discuss study findings and provide interpretation of the results. The results may be interpreted in relation to other relevant studies. It should not contain extensive repetition of the results sections. The impact or benefit from the study may be elaborated. 10. Conclusion: Emphasize the new and important aspects of the study. Link the conclusions with the goals of the study. 11. Acknowledgement: A single-paragraphed acknowledging contributors, helps and financial support received in completing the work. 12. References: Use Vancouver styled references. Provide superscript numeric figure in parentheses after referred phrase or referred name (use 1 for the first reference and 2, 3 respectively). Use the same number for the same reference. Never use abbreviation in references except the author’s first name initial and the journal title.

Writing references: 1. Journal Article

Example: Belshe RB, Coelingh K, Ambrose CS, Woo JC, Wu X. Efficacy of live attenuated influenza vaccine in children against influenza B viruses by lineage and antigenic similarity. Vaccine 2010; 28(9): 2149-56. 2. Text/Guideline Example: Greenberg AE, Clescri LS, Eaton AD, editors. Standard methods for the examination off water and wastewater. 18th ed. Washington DC: American Public Health Association; 1992. p. 9-94. 3. Chapter in the Text Example: Phillips SJ, Whisnant JP. Hypertension and stroke. In: Laragh JH, Brenner BM, editors. Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. 2nd ed. New York: Raven Press; 1995. p. 465-78. 4. Legal material Example: Preventive Health Amendments of 1993, Pub L No. 103-183, 107 Stat. 2226 (1993 Dec 14) 5. Organization as Author and Publisher (Including pamphlet & Package Insert) Example: Pharmaceutical Society of Australia. Medicines and driving [pamphlet]. Pharmaceutical Society of Australia; 1998. DR-7. Lamasil [package insert]. East Hanover (NJ): Sandoz Pharmaceuticals Corp; 1993. 6. Citing Conference Papers/Conference Proceedings Example: Bengtsson S, Solheim BG. Enforcement of data protection, privacy and security in medical informatics. In: Lun KC, Degoulet P, Piemme TE, Rienhoff O, editors. MEDINFO 92. Proceedings of the 7th World Congress on Medical Informatics; 1992 Sep 6-10; Geneva, Switzerland. Amsterdam: North-Holland; 1992. p. 1561-5.

7. Dissertation Example: Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly’s access and utilization[dissertation]. St. Louis (MO): Washington University; 1995. 8. Electronic material Journal on Internet Example: Morse SS. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg Infect Dis [serial online] 1995. Jan-Mar [cited 1996 Jun 5]; 1(1): [24 screens]. Available from: URL: http:// www.cdc.gov/ncidod/EID/eid.htm. Website Example: Hoffiman DL. St John’s Wort. [online]. [cited 1998 Jul 16]; [4 screens]. Available from: URL: http://www.healthy.net/library/books/hoffiman/materiamedica/stjohns.htm Manuscripts submission Register to submit article online at http://webapp1.dmsc.moph.go.th/journals/. All documents must be scanned and uploaded as attachments in the online submission system. All submissions will be acknowledged by the Editorial Board. Those unaccepted will also be notified. The Editorial Board reserves the right to edit any manuscripts for proper publication. Final proof The author should approve the final edited article in the process to confirm that he or she has read and concurred with of the whole content of the manuscript.

Revised date: August 16, 2019

นิพนธตนฉบับ

ว กรมวิทย พ 2565; 64 (1): 1-13

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders Using Molecular Karyotyping Siripakorn Sangkitporn,1 Chanane Wanapirak,2 Areerat Khorchai,3 Chonlada Yodtup,1 Sawitree Duangruang, 1 Natcha Panajamnong, 1 Phatcharaphon Nopprang, 1 Acharaporn Dambua,1 Patcharaporn Boonchu,1 and Somchai Sangkitporn1 Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Chiang Mai 50200, Thailand 3 The 50th Anniversary Mahavajiralongkorn Hospital, Ubon Ratchathani 34000, Thailand 1 2

ABSTRACT For the prevention and control of Down syndrome and other chromosomal disorders, laboratory

procedures for prenatal diagnosis should be established for high-risk pregnancies. A rapid molecular karyotyping assay, BACs-on-Beads (BoBsTM), has been developed for diagnosis of Down syndrome and common aneuploidies of chromosomes 13, 18, X and Y as well as nine microdeletion/microduplication syndromes. The study evaluated the performance of BoBsTM assay for prenatal diagnosis of Down syndrome and other chromosomal disorders in amniotic fluid samples (n = 1,004) obtained via amniocentesis between the 15th and 22th weeks of gestation in comparison with the gold standard conventional karyotyping. Interpretable results were obtained with BoBsTM assay in detection of 26 chromosome abnormalities comprising 23 aneuploidies (Down syndrome, n = 10; Edwards syndrome, n = 7; Klinefelter syndrome, n = 1; Patau syndrome, n = 1; Triple X syndrome, n = 1; and Turner syndrome n = 3) with 100% agreement with conventional karyotyping and three cases of microdeletion/microduplication syndromes [22q11.2 microdeletion (DiGeorge syndrome), n = 1 and 22q11.2 microduplication, n = 2] missed by conventional karyotyping. The assay has been implemented for prenatal diagnosis service at the National Institute of Health according to ISO 15189:2012. In conclusion, molecular BoBsTM assay provides a rapid and reliable method for detection of common aneuploidies and microdeletion/microduplication syndromes in uncultured prenatal samples and should be helpful in the prevention and control of Down syndrome and other chromosomal disorders in the country. Keywords: Chromosomal disorders, Down syndrome, Microdeletion/microduplication syndromes, Molecular karyotyping, Prenatal diagnosis

Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 25 November 2021 Revised: 1 Feburaury 2022

Accepted: 28 Feburaury 2022

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

1

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders

Introduction Down syndrome is one of the most common genetic birth defects caused by presence of all or part of a third copy of chromosome 21. The World Health Organization (WHO) predicts Down syndrome prevalence to range from 1 in 1,000 to 1 in 1,100 live births worldwide.(1) Children with Down syndrome usually have a wide range of intellectual impairment accompanied by a variety of congenital anomalies and delayed growth, which require special care in monitoring and treatment of several physiological systems.(2-6) The rate of live births with Down syndrome increases with maternal age: 0.61–1.46, 4.58, 15.7, and 33.50 per 1,000 births for mothers aged < 35, 35–39, 40–44, and 45–49 years, respectively;(7) however, the majority of children with Down syndrome are born to mothers aged < 35.(8-10) National public policies including additional financial and welfare support are recommended to provide adequate antenatal care for mothers and reduce economic burden of lifelong medical care for offspring with Down syndrome.(10) Appropriate laboratory procedures for prenatal screening and diagnosis are required in programs for prevention and control of Down and other syndromes of chromosomal abnormalities. Screening tests should be carried out based on maternal age, ultrasound for measurement of nuchal translucency, serum assays and non-invasive prenatal tests.(11-14) Pregnant women with high risk of having fetus with Down and other chromosomal abnormality syndromes are usually offered prenatal diagnosis, which consists of fetal karyotyping to analyze numerical and structural changes of all observed chromosomes and is considered the

2

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siripakorn Sangkitporn et al.

gold standard.(15) The advantage of this type of karyotyping is that both imbalanced as well as balanced chromosome aberrations are detectable, but suffers from several disadvantages, such as requirement of specialized technique, lengthy duration (10–14 days) of cell culture, possibility of cell culture failure and limitation in detection of chromosome abnormalities ~5 Mb in length, e.g., microdeletion and microduplication.(16-20) The lengthy wait for laboratory results imposes high-risk mothers to stress and anxiety prior to genetic counseling and appropriate intervention measures. Rapid aneuploidy diagnoses (RAD), such as bacterial artificial chromosomes (BACs)on-Beads (BoBs TM), fluorescence in situ hybridization (FISH), multiplex ligationdependent probe amplification and quantitative fluorescence polymerase chain reaction (QF-PCR), have been developed to detect common aneuploidies.(16, 17, 21) In several countries, implementation of RAD services for all prenatal samples are considered a necessary requirement in optimization of prenatal services.(22) For instance, in the UK, RAD is recommended as a stand-alone approach in a Down syndrome screening program.(17,23) A rapid molecular karyotyping BACson-Beads (BoBsTM) assay is a multiplex assay employing beads impregnated with different concentrations of two different fluorochromes to create an array of up to 100 different unique probes to measure DNA copy numbers at chromosome arm resolution, such as DNA gain or loss and genomic rearrangement.(21) This molecular karyotyping assay has been developed to detect common aneuploidies of chromosomes 13, 18, 21, X and Y, as well as nine common

การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสำหรับกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติที่พบบอย

chromosomal microdeletions/microduplications responsible for Angelman, Cri du Chat, DiGeorge, Langer-Giedion, Miller-Dieker, Prader-Willi, Smith-Magenis, WilliamsBeuren, and Wolf-Hirschhorn syndromes, selected based on their relatively high prevalence (1/2,000–1/300,000 population), significant morbidity/mortality, mild or unspecific ultrasound findings, strong genotypic and phenotypic correlation and changes typically too small to be detected by conventional karyotyping.(24,25) The assay is accepted by European countries, Australia and New Zealand.(26,27) The Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand, in collaboration with the Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, has the goal of developing a molecular karyotyping service for rapid detection of Down syndrome in prenatal amniotic fluid samples. In this study, molecular karyotyping BACs-on-Beads (BoBsTM) assay was evaluated as a potential rapid and reliable prenatal diagnosis for common aneuploidies of chromosomes 13, 18, 21, X and Y, as well as the nine common chromosomal microdeletions/ microduplications. The findings should provide baseline data for development of a prevention and control program for syndromes associated with common chromosomal abnormalities present in the country.

Materials and Methods Participants and sample collection Amniotic fluid samples (n = 1,008; 3–5 mL) were obtained from pregnant mothers at 15–22 weeks of pregnancy attending an antenatal clinic, Maharaj Nakorn Chiang Mai Hospital,

สิริภากร แสงกิจพร และคณะ

Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Chiang Mai, from August 2016 through October 2017. All subjects had undergone prenatal diagnosis by amniocentesis and chromosome study with an indication of high risk of having fetus with Down syndrome. All cases have been counseled and informed that amniotic fluid samples would be tested by using two techniques: the conventional one and the molecular karyotyping assay. The samples for the conventional method were sent to the cytogenetic unit of the Department of Anatomy, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, as usual. The others (3–5 mL of amniotic fluid samples) were stored and transported at 2–8๐C within 7 days after collection to the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Nonthaburi, Thailand. The study protocol was approved by the Ethics committee, Faculty of Medicine, Chiang Mai University (approval no. 188/2559, research ID 3862, study code OBG-2559-03862). Prior written consent was obtained from all participants. Molecular karyotyping protocol DNA was extracted from amniotic fluid using a QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Germany), concentrated and purity determined by measurement of A260 nm:A280 nm (NanoDrop 1000 spectrophotometer; Thermo Scientific, USA). Molecular karyotyping was carried out using a Prenatal-BoBs TM BACs-on-Beads assay (Perkin Elmer, Finland) to detect aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X and Y and nine microdeletion/microduplication regions. In brief, genomic DNA samples and reference DNA (male and female) samples (Promega, USA) วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

3

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders

were labeled with biotin, purified based on ultrafiltration (NucleoFast ® 96 PCR; Macherey-Nagel GmbH & Co., Germany) and hybridized to BoBsTM beads overnight at 52°C in a 96-well plate (Perkin Elmer, Finland), washed with wash buffer (Perkin Elmer, Finland), and then transferred to a 96-well filter plate (MultiScreen® HTS HV Sterile plate; Merck KGaA, Germany). The reactions were washed as described above, incubated at 37°C for 30 minutes with phycoerythrin-labeled streptavidin (Perkin Elmer, Finland), washed as described above, and then fluorescent signals were measured using a LuminexTM 200 spectrofluorometer (Luminex Corp., USA) (λ532 nm excitation, λ575 nm emission). Molecular karyotyping results were analysed by BoBsoft 2.0 analysis software (Perkin Elmer, Finland) and reported as fluorescence ratio relative to both normal female and male reference DNA at each chromosome locus of interest, acceptance requiring a coefficient of variation (CV) less than 6%. A sample is defined as normal disomic when fluorescence ratio for a chromosome region has a value within the lower and upper threshold limits (mean fluorescence ratio±2 SD) and as having a deletion or duplication at a specific chromosomal locus when fluorescence ratio is below lower or above upper threshold, respectively. Performance characteristics evaluation Performance characteristics including accuracy and precision were evaluated. Accuracy is defined as degree of compliance with standard karyotyping method (n = 1,004) carried out at the cytogenetic unit of the Department of Anatomy, Faculty of Medicine,

4

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siripakorn Sangkitporn et al.

Chiang Mai University. Precision of the assay is defined as between-run variation (n = 44) in fluorescence ratio of six chromosome loci (13C, 18C, 21C, 22q11.2 (DiGeorge syndrome, DGS), X and Y) compared to male and female DNA reference samples performed by three different operators in the same laboratory setting. Statistical analysis Primary output measure is concordance of any numerical, structural or submicroscopic chromosomal abnormalities between molecular karyotyping assay and conventional karyotyping. Data are presented as numbers and percentages. Maternal age and gestational age were expressed as median, range and interquartile range (IQR). Mean, standard deviation (SD) and percent coefficient of variation (CV) were used to estimate precision.

Results Participant ages, gestation status and DNA samples Participants (n = 1,008) had a median age of 36 years (range 15–48 years) with a median gestational age of 17 weeks (range 15–22 weeks). DNA concentration and A260 nm:A280 nm values of amniotic fluid samples were 9.7±5.78 ng/µL and 2.0±0.4, respectively. Molecular karyotyping assay Molecular karyotyping assay gave conclusive results for 1,004 samples; failure in four samples was due to maternal cells contamination. Among the samples karyotyped by molecular assay, 978 (97.4%) were normal disomic, 23 (2.3%) aneuploidy and 3 (0.3%) microdeletion/ microduplication (Table 1). As expected, Down

การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสำหรับกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติที่พบบอย

syndrome was the most common, followed by Edwards, Turner and 22q11.2 microduplication syndrome, while there was only one case each of DiGeorge, Klinefelter, Patau, and Triple X syndromes. For Patau, Edwards, Down and 22q11.2 microduplication syndromes, mean

สิริภากร แสงกิจพร และคณะ

fluorescence ratios of chromosomes 13, 18, 21 and 22q11.2 marker, respectively, were above the upper threshold limit, whereas that of DGS marker in DiGeorge syndrome was below the lower threshold (Figures 1–3, Table 2).

Table 1 Molecular karyotyping assay was compared to conventional karyotyping of amniocentesis samples obtained from mothers attending the Antenatal Clinic, Maharaj Nakorn Chiang Mai Hospital, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Chiang Mai, Thailand (August 2016-October 2017).

Normal, female Normal, male Down syndrome, female Down syndrome, male Edwards syndrome, female Edwards syndrome, male Patau syndrome, male Turner syndrome Mosaic Turner syndrome

Number of samples (%) (n = 1,004) 451 (44.9) 527 (52.5) 2 (0.20) 8 (0.8) 1 (0.1) 6 (0.6) 1 (0.1) 2 (0.2) 1 (0.1)

Triple X syndrome Klinefelter syndrome DiGeorge syndrome, female

1 (0.1) 1 (0.1) 1 (0.1)

36 45 38

36 45 38

22q11.2 microduplication syndrome, female 22q11.2 microduplication syndrome, male

1 (0.1)

26

26

1 (0.1)

27

27

Syndrome

Maternal age (years) Median

Range/ IQR

Molecular karyotype

36 36 34 41 38 37 36 25 36

15-47/35-38 17-48/35-39 30-38 34-46/39-45 38 27-41/33-40 36 21-29 36

XX XY XX,+21 XY,+21 XX,+18 XY,+18 XY,+13 X X/XX XXX XXY XX, del(22) (q11.2) XX, dup(22) (q11.2q11.2) XY, dup(22) (q11.2 q11.2)

Conventional karyotype 46, XX 46, XY 47, XX,+21 47, XY,+21 47, XX,+18 47, XY,+18 47, XY,+13 45, X mos 45, X/46, XX (45%/55%) 47, XXX 47, XXY 46, XX 46, XX 46, XY

IQR, Interquartile range mos, mosaic del, deletion dup, duplication

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

5

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders

A) Normal male

Siripakorn Sangkitporn et al.

B) Normal female

Figure 1 Molecular karyotyping profiles of normal male (A) and normal female (B). Red and blue spot represents sample:reference female and sample:reference male fluorescence ratio respectively. Performance characteristics of molecular karyotyping In the accuracy study, all samples showing aneuploidy were in agreement with conventional karyotyping, with no false-positive or false-negative results. Molecular karyotyping assay successfully detected three microdeletion/microduplication syndromes missed in the conventional method, including DiGeorge syndrome (22q11.2 microdeletion syndrome) (n = 1) and 22q11.2 microduplication syndrome (n = 2). Precision of the assay was determined as between-run variations of mean fluorescence ratio of six chromosome loci (13C, 18C, 21C, DGS, XC and YC) in male and female DNA internal control samples. Variability of between-run precision ranged 1.52-7.81% CV, considered satisfactory (Table 3).

6

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Application of molecular karyotyping for prenatal diagnosis Preliminary molecular karyotyping for prenatal diagnosis of Down syndrome and other chromosomal disorders was implemented at the Hematology Laboratory, Thailand National Institute of Health (Thai NIH) according to ISO 15189, ‘Medical laboratories-particular requirements for quality and competence’.(28,29) Three medical scientists were trained to perform the analysis according to standard operating procedures. Of 19 samples investigated, 2 Down syndrome fetuses were identified. Performance specifications of the procedure were monitored for each analytical batch using male and female DNA internal quality controls and the findings of the participants in inter-laboratory comparison

การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสำหรับกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติที่พบบอย

A) Trisomy 21 (Down syndrome)

สิริภากร แสงกิจพร และคณะ

B) Trisomy 18 (Edwards syndrome)

C) Trisomy 13 (Patau syndrome) Figure 2 Molecular karyotyping profiles of Trisomy 21 (A), Trisomy 18 (B) and Trisomy 13 (C). Red and blue spot represents sample:reference female and sample:reference male fluorescence ratio respectively. วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

7

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders

A) 22q11.2 microdeletion (DiGeorge syndrome)

Siripakorn Sangkitporn et al.

B) 22q11.2 microduplication

Figure 3 Molecular karyotyping profiles of 22q11.2 microdeletion (A) and 22q11.2 microduplication (B). Red and blue spot represents sample:reference female and sample:reference male fluorescence ratio respectively. Table 2 Molecular karyotyping assay fluorescence ratios in chromosomal disorders of 13C, 18C, 21C and 22q11.2 DiGeorge syndrome (DGS) from amniocentesis samples of mothers attending the Antenatal Clinic, Maharaj Nakorn Chiang Mai Hospital, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Chiang Mai, Thailand (August 2016-October 2017). Syndrome Down Edwards Patau DiGeorge 22q11.2 microduplication Normal

8

Number of samples 10 7 1 1 2 978

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

13C 0.98±0.03 0.98±0.02 1.29 1.03 0.99±0.01 0.99±0.03

Fluorescence ratio (mean±SD) 18C 21C 22q11 (DGS) 1.01±0.02 1.29±0.03 0.99±0.02 1.30±0.04 0.99±0.02 1.00±0.02 0.99 0.99 0.98 0.99 0.96 0.69 0.97±0.04 0.99±0.01 1.27±0.02 1.00±0.03 0.98±0.03 1.00±0.03

การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสำหรับกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติที่พบบอย

สิริภากร แสงกิจพร และคณะ

Table 3 Between-run precision of molecular karyotyping assay (n = 44). Control Normal, male Normal, female Normal, male Normal, female Normal, male Normal, female Normal, male Normal, female Normal, male Normal, female Normal, male Normal, female

Probe 13C 13C 18C 18C 21C 21C DGS DGS X X Y Y

were evaluated according ISO15189:2012 requirements. Turnaround time was reduced from three weeks using conventional method to three days with molecular karyotyping assay.

Discussion In Thailand, the prevalence of Down syndrome is 1.21 per 1,000 births(9) and in 2016 there were 1,100 newborns born with Down syndrome.(3) A national Down syndrome prenatal screening program was implemented in the country by the National Health Security Office (NHSO) in 2019 whereby mothers > 35 years of age in the second trimester are offered free blood serum screening tests and prenatal diagnosis for at risk mothers to determine chromosome abnormality.(30) Mothers carrying Down syndrome fetuses are counseled on the choice of carrying to term or having an abortion.(9) Although advanced maternal age is the most important risk factor for Down syndrome, Adams MM et al.(8) reported 80% of infants with Down syndrome were born to mothers under 35 years of age and hence, from

Min 0.96 0.98 0.95 0.96 0.93 0.95 0.96 0.95 0.79 0.96 0.94 0.46

Max 1.05 1.05 1.03 1.04 1.07 1.05 1.04 1.04 0.89 1.15 1.07 0.71

Mean 1.01 1.01 0.99 0.99 1.01 1.00 1.01 0.99 0.84 1.01 0.99 0.59

SD 0.02 0.02 0.02 0.02 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02 0.03 0.04 0.05

%CV 1.87 1.52 2.10 2.03 2.55 2.62 1.97 1.73 2.64 3.08 3.92 7.81

October 2020 the program was extended to all Thai pregnant women.(31) In order to assist in the national Down syndrome prevention program, the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand has collaborated with the Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Chiang Mai University to assess the reliability of molecular karyotyping assay for detection of common aneuploidy and microdeletion/ microduplication syndromes, in comparison with conventional gold standard karyotyping technique. Aneuploidies detected by molecular karyotyping assay was in concordance with those observed by the gold standard karyotyping technique and in addition three cases of microdeletion syndromes missed by conventional karyotyping were detected. Precision of the assay was quite high, with an overall %CV of between-run precision within the required range. The major advantage of molecular karyotyping is its ability to provide more informative results than FISH and QF-PCR วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

9

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders

methods that can only reveal common aneuploidies,(20) namely detection of microdeletion/microduplication syndromes. Total reagent and consumable costs per sample in molecular karyotyping assay are comparable with FISH and QF-PCR but less than array-comparative genomic hybridization (CGH).(18,21,32) In addition, molecular karyotyping assay is less labor-intensive and suitable for a high throughput platform, with a turnaround time within three days. However, molecular karyotyping assay cannot detect chromosome inversions, balanced translocations, point mutations, polyploidies, alterations in methylation and low-level mosaicism.(18,33,34) Both molecular karyotyping assay and conventional karyotyping alone could not detect all fetal chromosomal abnormalities. A combination of these techniques should improve the detection and accuracy of prenatal diagnosis. (19,25,33) In 2019, Miao Z et al(25) reported that the combined use of molecular karyotyping assay and conventional karyotyping could detect more fetal chromosomal abnormalities (4.51%) than either molecular karyotyping assay (2.97%) and conventional karyotyping (4.04%) alone.

Conclusion Molecular karyotyping assay is as reliable as conventional gold standard karyotyping in detecting common aneuploidies and is able to identify common microdeletion/microduplication syndromes. Its high accuracy, low sample volume requirement, ease in implementation, adaptation to a high throughput platform and rapid turnaround time should assist in improving acceptance of the national Down syndrome prenatal screening program especially among late antenatal care pregnant women.

10

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siripakorn Sangkitporn et al.

Acknowledgements The research was supported by a grant from the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health, Thailand. The authors gratefully thank Professor Dr. Prapon Wilairat for valuable suggestions and assistance in editing the manuscript. The authors thank Ms. Panyakamol Chandrasakha and hematology laboratory staffs for their kind assistance.

Conflicts of Interest Declaration The authors declare no conflicts of interest.

References 1. Al-Biltagi M. Epidemiology and prevalence of Down syndrome. In: Al-Biltagi M, editor. Down syndrome children - an update. Sharjah, U.A.E: Bentham Science Publishers; 2015. p. 3-44. 2. Asim A, Kumar A, Muthuswamy S, Jain S, Agarwal S. Down syndrome: an insight of the disease. J Biomed Sci 2015; 22: 41. (9 pages). 3. Pangkanon S, Sawasdivorn S, Kuptanon C, Kabchan P. The prevalence of congenital anomalies in Thailand. Thai J Pediatr 2016; 55(2): 85-92. 4. Rojnueangnit K, Khaosamlee P, Chunsuwan I, Vorravanpreecha N, Lertboonnum T, Rodjanadit R, et al. Quality of life and comprehensive health supervision for children with Down syndrome in Thailand. J Community Genet 2020; 11(3): 351-8. 5. van den Driessen Mareeuw FA, Coppus AMW, Delnoij DMJ, de Vries E. Quality of health care according to people with Down syndrome, their parents and support staff-A qualitative exploration. J Appl Res Intellect Disabil 2020; 33(3): 496-514.

การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสำหรับกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติที่พบบอย 6. Weijerman ME, de Winter JP. Clinical practice. The care of children with Down syndrome. Eur J Pediatr 2010; 169(12): 1445-52. 7. Moorthie S, Blencowe H, Darlison MW, Gibbons S, Lawn JE, Mastroiacovo P, et al. Chromosomal disorders: estimating baseline birth prevalence and pregnancy outcomes worldwide. J Community Genet 2018; 9(4): 377-86. 8. Adams MM, Erickson JD, Layde PM, Oakley GP. Down's syndrome. Recent trends in the United States. JAMA 1981; 246(7): 758-60. 9. Jaruratanasirikul S, Kor-Anantakul O, Chowvichian M, Limpitikul W, Dissaneevate P, Intharasangkanawin N, et al. A populationbased study of prevalence of Down syndrome in Southern Thailand. World J Pediatr 2017; 13: 63-9. 10. Park GW, Kim NE, Choi EK, Yang HJ, Won S, Lee YJ. Estimating nationwide prevalence of live births with Down syndrome and their medical expenditures in Korea. J Korean Med Sci 2019; 34(31): e207. (12 pages). 11. Liu H, Gao Y, Hu Z, Lin L, Yin X, Wang J, et al. Performance evaluation of NIPT in detection of chromosomal copy number variants using low-coverage whole-genome sequencing of plasma DNA. PLoS One 2016; 11(7): e0159233. (11 pages). 12.Dahl F, Ericsson O, Karlberg O, Karlsson F, Howell M, Persson F, et al. Imaging single DNA molecules for high precision NIPT. Sci Rep 2018; 8: 4549. (8 pages). 13. Rattanasiri T. Common obstetrics problems in fetal diagnosis and treatment. Khon Kaen, Thailand: Faculty of Medicine, Khon Kaen University; 2018. 14. Wanapirak C, Piyamongkol W, Sirichotiyakul S, Tongprasert F, Srisupundit K, Luewan S, et al. Fetal Down syndrome screening models for developing countries; Part I: Performance of maternal serum screening. BMC Health Serv Res 2019; 19: 897. (7 pages).

สิริภากร แสงกิจพร และคณะ

15. Silva M, de Leeuw N, Mann K, Schuring-Blom H, Morgan S, Giardino D, et al. European guidelines for constitutional cytogenomic analysis. Eur J Hum Genet 2019; 27: 1-16. 16. Bui TH. Prenatal cytogenetic diagnosis: gone FISHing, BAC soon! Ultrasound Obstet Gynecol 2007; 30(3): 247-51. 17. Gekas J, van den Berg DG, Durand A, Vallée M, Wildschut HI, Bujold E, et al. Rapid testing versus karyotyping in Down's syndrome screening: cost-effectiveness and detection of clinically significant chromosome abnormalities. Eur J Hum Genet 2011; 19: 3-9. 18. Vialard F, Simoni G, Aboura A, De Toffol S, Molina Gomes D, Marcato L, et al. Prenatal BACs-on-Beads™: a new technology for rapid detection of aneuploidies and microdeletions in prenatal diagnosis. Prenat Diagn 2011; 31(5): 500-8. 19. Fang Y, Wang G, Gu L, Wang J, Suo F, Gu M, et al. Application of karyotype analysis combined with BACs-on-Beads for prenatal diagnosis. Exp Ther Med 2018; 16(4): 2895-900. 20. Galehdari H, Barati M, Mahmoudi M, Shahbazian N, Masihi S, Zamani M, et al. Validity of chromosomal aneuploidies testing during pregnancy: a comparison of karyotype, interphase-FISH and QF-PCR techniques. Biomed Res 2018; 29(10): 2164-8. 21. Choy KW, Kwok YK, Cheng YKY, Wong KM, Wong HK, Leung KO, et al. Diagnostic accuracy of the BACs-on-Beads™ assay versus karyotyping for prenatal detection of chromosomal abnormalities: a retrospective consecutive case series. BJOG 2014; 121(10): 1245-52. 22. Mann K, Fox SP, Abbs SJ, Yau SC, Scriven PN, Docherty Z, et al. Development and implementation of a new rapid aneuploidy diagnostic service within the UK National Health Service and implications for the future of prenatal diagnosis. Lancet 2001; 358(9287): 1057-61. วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

11

Prenatal Diagnosis of Down Syndrome and Common Chromosomal Disorders 23. UK Department of Health. Our inheritance, our future: realising the potential of genetics in the NHS. London: TSO (The Stationery Office); 2003. 24. García-Herrero S, Campos-Galindo I, Martínez-Conejero JA, Serra V, Olmo I, Lara C, et al. BACs-on-Beads technology: a reliable test for rapid detection of aneuploidies and microdeletions in prenatal diagnosis. Biomed Res Int 2014; 2014: 590298. (7 pages). 25. Miao Z, Liu X, Hu F, Zhang M, Yang P, Wang L. Combined use of bacterial artificial chromosomes-on-beads with karyotype detection improves prenatal diagnosis. Mol Cytogenet 2019; 12: 9. (8 pages). 26. Hastings R, Howell R, Bricarelli FD, Kristoffersson U, Cavani S. Specific constitutional cytogenetic guidelines: A common European framework for quality assessment for constitutional, acquired and molecular cytogenetic investigations. ECA Newslett 2012: 30; 11-9. 27. McGillivray G, Hui L, Halliday J. Prenatal screening and diagnosis of chromosomal and genetic conditions in the fetus in pregnancy. The Royal Australian and New Zealand College of Obstetricians and Gynaecologists; 2016. 28. ISO 15189:2012. Medical laboratoriesRequirements for quality and competence. 3rd ed. Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization; 2012.

12

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siripakorn Sangkitporn et al.

29. Schneider F, Maurer C, Friedberg RC. International Organization for Standardization (ISO) 15189. Ann Lab Med 2017; 37(5): 365-70. 30. Panichkriangkrai W, Topothai C, Saengruang N, Thammatach-aree J, Tangcharoensathien V. Universal access to sexual and reproductive health services in Thailand: achievements and challenges. Sex Reprod Health Matters 2020; 28(2): 1-6. 31. Kunsiripunyo J, Srirot W. Preparation of counseling nurses to support Down syndrome screening system in all age groups of pregnant women. JPNC 2021; 32: 237-52. 32. Mellali S, Haoud K, Gouas L, Khaled MB, Vago P, Moulessehoul S. Prenatal BoBsTM in the cytogenetic analysis of products of spontaneous miscarriage. S Afr Med J 2015; 105(10): 870-3. 33. Farra C, Nassar AH, Mirza F, Abdouni L, Souaid M, Awwad J. BACs-on-Beads™ assay, a rapid aneuploidy test, improves the diagnostic yield of conventional karyotyping. Mol Biol Rep 2020; 47: 169-77. 34. Huang H, Zhang M, Wang Y, Lin N, He D, Chen M, et al. Application of the BACs-on-Beads™ assay for rapid prenatal detection application of BoBs™ for PND of aneuploidies and microdeletions. Mol Reprod Dev 2018; 85(2): 146-54.

การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสำหรับกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติที่พบบอย

สิริภากร แสงกิจพร และคณะ

การตรวจวินจิ ฉัยกอนคลอดสำหรับกลุม อาการดาวนและ โครโมโซมผิดปกติทพี่ บบอย โดยวิธี Molecular Karyotyping สิริภากร แสงกิจพร1 ชเนนทร วนาภิรักษ2 อารีรัตน ขอไชย3 ชลลดา ยอดทัพ1 สาวิตรี ดวงเรือง1 ณัชชา ปาณะจำนง1 พัชราภรณ นพปรางค1 อัจฉราพร ดำบัว1 พัชราภรณ บุญชู1 และ สมชาย แสงกิจพร1 กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 ภาควิชาสูติศาสตรและนรีเวชวิทยา คณะแพทยศาสตร มหาวิทยาลัยเชียงใหม 50200 3 โรงพยาบาล ๕๐ พรรษา มหาวชิราลงกรณ อุบลราชธานี 34000 1 2

บทคัดยอ การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดมีความสําคัญในการควบคุมและปองกันกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติ

ในหญิงตั้งครรภที่มีความเสี่ยงสูง การตรวจวินิจฉัยกอนคลอดโดยวิธีทางอณูพันธุศาสตร BACs-on-Beads (BoBsTM) เป น วิ ธี ต รวจวิ นิ จ ฉั ย กลุ ม อาการดาวน แ ละโครโมโซมผิ ด ปกติ คู ที่ 13, 18, X และ Y รวมถึ ง microdeletion/ microduplication syndromes 9 ชนิด อยางรวดเร็ว การศึกษานี้มีวัตถุประสงคเพื่อประเมินประสิทธิภาพการตรวจ วินิจฉัยโดยวิธีอณูพันธุศาสตรในตัวอยางน้ําคร่ําของหญิงตั้งครรภที่มีอายุครรภ 15-22 สัปดาห จํานวน 1,004 ราย ศึกษา เปรียบเทียบกับวิธี conventional karyotyping จากการเพาะเลี้ยงน้ําคร่ําซึ่งเปนวิธีมาตรฐาน ผลการศึกษาพบความผิดปกติ ทางโครโมโซม 26 ตัวอยาง เปน aneuploidies 23 ตัวอยาง (Down syndrome 10 ตัวอยาง Edwards syndrome 7 ตัวอยาง Klinefelter syndrome 1 ตัวอยาง Patau syndrome 1 ตัวอยาง Triple X syndrome 1 ตัวอยาง และ Turner syndromes 3 ตัวอยาง) ผลทั้งหมดสอดคลองกับวิธีมาตรฐาน นอกจากนี้ยังสามารถวินิจฉัย microdeletion/ microduplication syndromes ได 3 ตัวอยาง (22q11.2 microdeletion 1 ตัวอยาง และ 22q11.2 microduplication 2 ตัวอยาง) ซึง่ วิธดี งั้ เดิมตรวจไมพบ วิธกี ารนีไ้ ดบรู ณาการสูก ารใหบริการตามมาตรฐานสากล ISO 15189:2012 ณ สถาบันวิจยั วิทยาศาสตร สาธารณสุข การตรวจทางอณูพันธุศาสตรนับเปนวิธีที่นาเชื่อถือและรวดเร็วในการตรวจวินิจฉัยกอนคลอดสําหรับโครโมโซมผิด ปกติที่พบบอย ทั้งชนิด aneuploidies และ microdeletion/microduplication syndromes โดยไมตองเพาะเลี้ยงน้ําคร่ํา นับเปนการสนับสนุนการควบคุมและปองกันกลุมอาการดาวนและโครโมโซมผิดปกติของประเทศ คําสําคัญ: โครโมโซมผิดปกติ, กลุมอาการดาวน, Microdeletion/microduplication syndrome, อณูพันธุศาสตร, การตรวจวินิจฉัยกอนคลอด

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

13

นิพนธตนฉบับ

ว กรมวิทย พ 2565; 64 (1): 14-24

การตรวจวินจิ ฉัยการติดเชือ้ HIV-1 จากตัวอยาง หยดเลือดแหงบนกระดาษซับโดยตรง ดวยวิธี real-time PCR วิโรจน พวงทับทิม1 รัชณีกร ใจซื่อ1 นวลจันทร วิจักษณจินดา2 และ อาชวินทร โรจนวิวัฒน3 สถาบันชีววิทยาศาสตรทางการแพทย กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 สำนักวิชาการวิทยาศาสตรการแพทย กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 3 สถาบันวิจัยวิทยาศาสตรสาธารณสุข กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000 1 2

บทคัดยอ การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ในเด็กที่คลอดจากแมท่ีติดเชื้อโดยวิธี real-time PCR ดวยตัวอยาง

หยดเลือดแหงบนกระดาษซับ (dried blood spot: DBS) ทําใหเขาถึงการบริการการตรวจไดงาย เพื่อใหไดวิธีตรวจที่สะดวก และประหยัดเวลามากขึ้นโดยตัดขั้นตอนการสกัดสารพันธุกรรม คณะผูวิจัยไดพัฒนาวิธีการตรวจตัวอยาง DBS โดยตรงดวย วิธี real-time PCR (direct DBS real-time PCR) และเปรียบเทียบวิธีดังกลาวที่ใชชุดน้ํายา Coyote Bioscience กับ วิธีปจจุบันที่มีการสกัดตัวอยางกอนการตรวจดวยชุดน้ํายา KAPA Probe Fast qPCR kit โดยใช primer และ probe ชุด เดียวกัน ประเมินขีดจํากัดของการทดสอบ (limit of detection: LOD) โดยการตรวจสารพันธุกรรม HIV-1 ในเซลลเพาะเลีย้ ง 8E5 ประเมินความไวและความจําเพาะโดยการตรวจ DBS ที่เหลือจากงานบริการที่สงตรวจวินิจฉัย ณ สถาบันชีววิทยาศาสตร ทางการแพทย กรมวิทยาศาสตรการแพทย ระหวางป พ.ศ. 2559–2561 รวม 287 ตัวอยาง ประกอบดวยตัวอยางติดเชือ้ 88 ตัวอยาง ไมติดเชื้อ 199 ตัวอยาง พบวา LOD ของวิธี direct DBS real-time PCR และวิธีปจจุบันเทากับ 200 และ 500 cells/mL ของเลือด ตามลําดับ โดยวิธี direct DBS real-time PCR มีความไวรอยละ 100 (88/88) ความจําเพาะรอยละ 90.5 (180/199) และมีความสอดคลองกับสภาวะการติดเชือ้ รอยละ 93.4 (268/287) ที่ kappa เทากับ 0.853 (p < 0.001) การศึกษานี้ แสดงใหเห็นวาวิธี direct DBS real-time PCR นอกจากลดระยะเวลาการตรวจวิเคราะหไดแลว ยังมี LOD ดีกวาวิธีที่ใช ในปจจุบัน แตยังมีขอจํากัดเรื่องผลบวกปลอม การพัฒนาปรับปรุงใหวิธีนี้มีความจําเพาะมากกวารอยละ 99.5 ตามมาตรฐาน กําหนดของสํานักงานคณะกรรมการอาหารและยา จะทําใหสามารถนําวิธีนี้มาใชงานบริการไดในอนาคต คําสําคัญ: การตรวจวินิจฉัย HIV-1, real-time PCR, ตัวอยางหยดเลือดแหงบนกระดาษซับโดยตรง

Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 30 September 2021 Revised: 8 December 2021

14

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Accepted: 3 Feburaury 2022

การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ดวยวิธี direct DBS real-time PCR

วิโรจน พวงทับทิม และคณะ

บทนํา การใหบริการตรวจวิเคราะหหาการติดเชื้อ HIV-1 ในเด็ ก ที่ ค ลอดจากแม ที่ ติ ด เชื้ อ ของกรมวิ ท ยาศาสตร การแพทย แ ละเครื อ ข า ยศู น ย วิ ท ยาศาสตร ก ารแพทย 12 แหง ในปจจุบนั ใชวธิ ี real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) โดยใชชุดน้ำยาตรวจที่ พัฒนาขึ้นเอง (in-house)(1-3) ประกอบดวยขั้นตอนที่ สำคัญ คือ การสกัดสารพันธุกรรมจากตัวอยางสงตรวจ การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเปาหมายและการตรวจ วัดสัญญาณแบบ real-time เปนวิธีที่มีความไว และ ความจำเพาะสูง สามารถใชตรวจตัวอยางทีม่ ปี ริมาตรนอย เช น ตั ว อย า งชนิ ด หยดเลื อ ดแห ง บนกระดาษซั บ (dried blood spot: DBS) ซึง่ เปนตัวอยางทีผ่ ใู ชบริการ ตรวจทางห อ งปฏิ บั ติ ก ารส ว นใหญ นิ ย ม เนื่ อ งจากมี ความสะดวกในการเก็บรักษาสภาพและการขนสงตัวอยาง อีกทัง้ ยังลดโอกาสการปนเปอ นเชือ้ โรคและอันตรายทีเ่ กิด จากการแตกหักของหลอดบรรจุตวั อยาง ทำใหเพิม่ โอกาส ในการเขาถึงบริการตรวจของประชาชน การตรวจดวยเทคนิค real-time PCR มีขอดี กวาวิธี PCR แบบดั้งเดิม (conventional PCR) คือ ลดเวลาในการตรวจวิ เ คราะห เนื่ อ งจากไม มี ขั้ น ตอน การทำเจลอิเล็กโทรโฟเรซีส (gel electrophoresis) เพือ่ ตรวจสอบสารพันธุกรรมเปาหมายทีเ่ พิม่ จำนวน และ ลดโอกาสการเกิดผลบวกปลอมจากการปนเปอนของ PCR product อยางไรก็ตามวิธีการตรวจวิเคราะหของ เครือขายหองปฏิบตั กิ ารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ทีใ่ ห บริการในปจจุบันยังมีชองวางที่สามารถพัฒนา เพื่อเพิ่ม ประสิทธิภาพในการใหบริการ โดยขั้นตอนที่มีความเปน ไปได คือ ขั้นตอนการสกัดสารพันธุกรรมจากสิ่งสงตรวจ ชนิด DBS ซึ่งเปนขั้นตอนที่สำคัญและใชระยะเวลาใน การปฏิบัติงานประมาณหนึ่งชั่วโมง ปจจุบัน DBS เปนตัวอยางที่ไดรับการยอมรับใน การตรวจวินิจฉัยโรคในเด็ก(4-6) เชน การตรวจหาภาวะ พรองไทรอยดฮอรโมน และการตรวจหาสารพันธุกรรม ของเชื้ อ HIV-1 เพราะมี ค วามสะดวกในการเก็ บ และขนส ง ตั ว อย า ง แต ตั ว อย า ง DBS มี ส ารยั บ ยั้ ง PCR (inhibitor) จากเลือด เชน โปรตีน โลหะหนัก ฮี โ มโกลบิ น หรื อ เยื่ อ กระดาษที่ น ำมาใช เ ป น กระดาษ

ซั บ เลื อ ด ขั้ น ตอนการสกั ด DNA ออกจากกระดาษ จะลดความคลาดเคลื่อนของผลตรวจทางหองปฏิบัติการ(7) มีการศึกษาความเปนไปไดในการใชตัวอยางจากเลือด (whole blood) หรือ DBS โดยตรงในการทำ PCR โดยไม มี ขั้ น ตอนการสกั ด สารพั น ธุ ก รรมออกจาก ตัวอยาง(8-11) จำเปนตองใชน้ำยา PCR ชนิดพิเศษ เชน ใช เ อนไซม DNA polymerase ที่ ส ามารถทนต อ สารยับยั้ง และปรับปรุงชนิดสวนประกอบ ความเขมขน ของเกลือ (salt composition) และกลุมสาร detergent รวมทั้งเพิ่มขั้นตอนการทำใหเซลลแตกออกและ DNA หลุ ด จากนิ ว เคลี ย ส เพื่ อ ทำให ป ระสิ ท ธิ ภ าพการเพิ่ ม ปริมาณสารพันธุกรรมเปาหมายเกิดไดดีขึ้น แมวา เทคโนโลยีนำ้ ยา PCR แบบใหมนจี้ ะสามารถ ลดขั้ น ตอนการปฏิ บั ติ ง านในส ว นของการสกั ด สาร พันธุกรรมจากตัวอยางสิง่ สงตรวจแบบ DBS ได และอาจ มีความไวเพียงพอทีจ่ ะใชการตรวจวิเคราะหในงานบริการ ประจำ แตยังขาดขอมูลประสิทธิภาพการตรวจวินิจฉัย ดวยเทคนิคการตรวจ DBS โดยตรงในกลุมตัวอยาง ศึกษาทางคลินกิ (12) ดังนัน้ คณะผูว จิ ยั จึงไดทำการศึกษาใน ห อ งปฏิ บั ติ ก ารโดยใช ตั ว อย า ง DBS ของเด็ ก ไทย อายุนอยกวา 24 เดือน ที่คลอดจากแมที่ติดเชื้อ HIV-1 เพื่อประเมินประสิทธิภาพการตรวจในดานความไวและ ความจำเพาะของวิธกี ารตรวจตัวอยาง DBS โดยตรงดวย วิธี real-time PCR (direct DBS real-time PCR) เปรียบเทียบกับวิธีที่ใหบริการในปจจุบันดวยชุดน้ำยา ตรวจที่พัฒนาขึ้นใชเอง

วัสดุและวิธีการ ตัวอยางศึกษา ชุดตัวอยางเพื่อประเมินขีดจำกัดของการตรวจวิเคราะห เตรียมชุดตัวอยาง (sample panel) โดยนำ เซลล 8E5 (CRL-8993, American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) ซึ่งเปน Human Lymphoblastic Leukemia ที่ มี ส ารพั น ธุ ก รรม whole genome ของเชื้อไวรัส HIV-1 จำนวน 1 ชุด ตอเซลล (1 copy/cell) มานับจำนวนเซลลดวยเครื่อง วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

15

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Sample

Wiroj Puangtabtim et al.

อัตโนมัติ (Sysmex XT-1800i cell counter, Sysmex Coperation, Chuo-ku, Kobe, Japan) แลวจึง เตรียมความเขมขนเซลล 8E5 ที่ 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 และ 600 cells/mL ดวยการเติมเซลล 8E5 ลงในเลือดครบสวน (whole blood) จากผูบริจาค ที่มีจำนวนเม็ดเลือดขาวไมนอยกวา 4,000 cells/ μL และมีผลตรวจการติดเชื้อ HIV-1 เปนลบ (negative) ด ว ยวิ ธี ม าตรฐานการตรวจคั ด กรองเลื อ ดบริ จ าคของ ศูนยบริการโลหิตแหงชาติ สภากาชาดไทย ผสมเซลล 8E5 และเลื อ ดให เ ข า กั น ดี แ ล ว หยดส ว นผสมปริ ม าตร 50 μL ลงบนกระดาษซับเลือด 903 Thailand NBS card (Eastern Business Forms Inc, Mauldin, SC, USA) ที่มีรอยพิมพวงกลมเสนผานศูนยกลาง 10 mm จำนวน 6 วงตอกระดาษซับเลือด 1 แผน ผึ่งตัวอยางให แหงที่อุณหภูมิหอง ในที่รม ไมนอยกวา 24 ชั่วโมง

การตรวจคัดกรองเลือดบริจาค ของศูนยบริการโลหิต แหงชาติ สภากาชาดไทย แลวหยดลงบนกระดาษซับเลือด 903 Thailand NBS card จำนวน 6 วงเลือดตอ 1 แผน ตัวอยางกระดาษซับเลือดควบคุมคุณภาพชนิด บวก (DBS positive control sample) เตรียมโดย เจือจางเซลลมาตรฐาน 8E5 (ATCC CRL-8993) ดวย เลือดผูบ ริจาคทีไ่ มตดิ เชือ้ HIV-1 ใหมจี ำนวน 1 cell/μL แลวหยดลงบนกระดาษซับเลือด 903 Thailand NBS card จำนวน 6 วงเลือดตอ 1 แผน

ตัวอยางศึกษาทางคลินิก (clinical samples) ตัวอยาง DBS ของเด็กที่มีการสงตัวอยางตรวจ อยางนอย 2 ครั้ง ในชวงอายุระหวาง 1 วัน ถึง 12 เดือน และมีผลตรวจทางซีโรโลยี เพื่อสรุปสถานะการติดเชื้อ รายบุคคลที่อายุ 24 เดือน (13-15) โดยเปนสิ่งสงตรวจ ที่เหลือ (left over samples) จากงานบริการตรวจ วินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 จากแมสูลูก ของสถาบัน ชีววิทยาศาสตรทางการแพทย ระหวางป พ.ศ. 2559– 2561 จำนวน 287 ตัวอยาง แบงเปน ตัวอยางที่มีผลการ ตรวจเปนบวก (positive) ตอเชื้อ HIV-1 วิธี PCR ติดตอกันอยางนอย 2 ครัง้ รวมกับขอมูลสถานะการติดเชือ้ ของเด็กที่อายุ 24 เดือน จำนวน 88 ตัวอยาง เพื่อศึกษา ความไวทางคลินิก (clinical sensitivity) และตัวอยาง ที่มีผลการตรวจเปนลบ (negative) ตอเชื้อ HIV-1 วิธี PCR ติดตอกันอยางนอย 3 ครั้ง รวมกับขอมูลสถานะ การไมติดเชื้อของเด็กที่อายุ 24 เดือน เพื่อศึกษาความ จำเพาะทางคลินิก (clinical specificity) จำนวน 199 ตัวอยาง ตั ว อย า งควบคุ ม คุ ณ ภาพการทดสอบ (control samples) ตัวอยางกระดาษซับเลือดควบคุมคุณภาพชนิดลบ (DBS negative control sample) เตรียมจากเลือด ผูบ ริจาคทีม่ จี ำนวนเม็ดเลือดขาวไมนอ ยกวา 4,000 cells/μL และผลตรวจตอเชื้อ HIV-1 เปนลบดวยวิธีมาตรฐาน

16

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

การขออนุมตั จิ ากคณะกรรมการพิจารณาการศึกษาวิจยั ในคน การใชตัวอยางเลือดที่เหลือจากงานบริการการตรวจ วิเคราะหไดรับการอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณา การวิ จั ย ในคน กรมวิ ท ยาศาสตร ก ารแพทย เลขที่ EC116/62 การตรวจหาเชื้อ HIV-1 วิธีที่ใหบริการในปจจุบันดวย ชุดน้ำยาตรวจที่พัฒนาขึ้นใชเอง การเตรียมตัวอยาง DNA สกั ด ตั ว อย า ง DBS ที่ ใ ช เ ป น ตั ว อย า งศึ ก ษา ขีดจำกัดของการตรวจวิเคราะห ตัวอยางศึกษาทางคลินิก และตัวอยางควบคุมคุณภาพการทดสอบตัวอยางละ 2 วง (เสนผานศูนยกลาง 10 mm) หรือคิดเปนปริมาตรของ เลือด 100 μL ดวยวิธมี าตรฐานชุดน้ำยา QIAsymphony DSP DNA (QIAGEN, Hilden, Germany) ดวย เครื่ อ งสกั ด อั ต โนมั ติ QIAsymphony ® Automate Extraction (QIAGEN, Hilden, Germany) ไดตัวอยาง DNA ปริมาตร 50 μL เก็บที่ -20 ํC จนกวา จะใชงาน การตรวจ real-time PCR การตรวจหาสารพั น ธุ ก รรมของไวรั ส HIV-1 ใชการตรวจ LTR gene และใชการตรวจ human RNAseP gene เพื่อเปน internal control ดวยวิธี Duplex real-time PCR(1) โดยผสมน้ำยาสำเร็จรูป KAPA Probe Fast qPCR kit (KAPA Biosystems, MA, USA) กับ HIV-1 LTR primer/probe และ human RNAseP primer/probe ในปริ ม าตร 15 μL รายละเอียดลำดับนิวคลิโอไทดและความเขมขน ของ primers และ probes ดังแสดงในตารางที่ 1 เติม

การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ดวยวิธี direct DBS real-time PCR

DNA 5 μL รวมเปนสวนผสมทั้งหมด 20 μL นำไปเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรมและอานผลดวยเครื่อง ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) โดยตั้งการทำงาน pre-amplification ที่ 50 Cํ นาน 2 นาที และ 95 Cํ นาน 2 นาที หลังจากนัน้ ทำ PCR จำนวน 45 รอบ ประกอบดวย denature step ที่ 95 ํC นาน 15 วินาที annealing และ extension step ที่ 52 ํC นาน 30 วินาที การควบคุมคุณภาพและแปลผล การตรวจตัวอยางทดสอบ มีการตรวจตัวอยาง ควบคุมชนิดบวกและชนิดลบควบคูดวยทุกครั้ง โดยใช ตัวอยางควบคุมชนิดบวกที่มี HIV-1 DNA ที่ 5 copies/ reaction ต อ งพบสั ญ ญาณของการเพิ่ ม ปริ ม าณสาร พันธุกรรมของ HIV-1 LTR gene ที่มีคา Cycle threshold (Ct) ต่ำกวา 35 และพบสัญญาณการเพิ่ม ปริมาณสารพันธุกรรมของ human RNAseP gene มีคา Ct ต่ำกวา 25 สวนตัวอยางควบคุมชนิดลบ พบ เฉพาะสัญญาณการเพิ่มปริมาณของ human RNAseP gene เทานั้น ตัวอยาง DNA ที่พบคา Ct ใน LTR gene และ human RNAseP gene ครบทั้ง 2 ยีน จะถูกแปล

วิโรจน พวงทับทิม และคณะ

ผลตรวจเปนบวก สวนตัวอยางตรวจลบจะตรวจพบเฉพาะ Ct ของ human RNAseP gene เทานัน้ ตัวอยางทีต่ รวจ ไมพบคา Ct ของทัง้ 2 ยีน จะรายงานผลวาตรวจวิเคราะห ไมได (invalid) การตรวจหาเชื้อ HIV-1 ดวยวิธีการตรวจตัวอยาง DBS โดยตรงดวยวิธี real-time PCR (direct DBS real-time PCR) การเตรียมตัวอยาง DNA เจาะ DBS ที่เปนตัวอยางศึกษา LOD ตัวอยาง ศึกษาทางคลินิก และตัวอยางควบคุมคุณภาพชนิดบวก และชนิดลบ ขนาดเสนผานศูนยกลาง 3 mm (คิดเปน ปริมาตรของเลือด 3 μL/ตัวอยาง)(16,17) จำนวนตัวอยางละ 1 วง เพื่อนำไปทำ PCR ในขั้นตอนถัดไป การตรวจ real-time PCR ผสมน้ำยา DirectDetectTM QRT-PCR kit (Coyote Bioscience, Beijing, China) กับ primers และ probes ที่มีลำดับนิวคลีโอไทดและความเขมขน เชนเดียวกับวิธีการที่ใชชุดน้ำยาตรวจที่พัฒนาขึ้นเอง ใน ปริมาตร 50 μL ใส DBS ที่เจาะไว 1 วง นำไปเพิ่ม

ตารางที่ 1 รายละเอียดลำดับนิวคลิโอไทดและความเขมขนของ primers/probes ที่ใชการศึกษา(1) Target gene HIV-1 LTR gene (89 bp) forward primer reverse primer probe Human RNAseP gene (65 bp) forward primer reverse primer probe

Final concention (nM) 300 500 400

Primer and probe sequence (5’-3’) TGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA TCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG FAM-AAGTAGTGTGTGCCCGTCTGT-BHQ

GenBank Accession no. AF033819.3 61- 89 127-149 97-117 AK296196.1

100 200 400

AGATTTGGACCTGCGAGCG GAGCGGCTGTCTCCACAAGT HEX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGC-TAMRA

28-46 73-92 49-71

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

17

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Sample

Wiroj Puangtabtim et al.

ปริมาณสารพันธุกรรมและอานผลดวยเครื่อง Mini8 Real-Time PCR System (Coyote Bioscience, Beijing, China) ซึ่งตั้งการทำงานไวเพื่อทำ preamplification ที่ 95 ํC นาน 5 วินาที ที่ 45 ํC นาน 5 วินาที จำนวน 15 รอบ ที่ 95 ํC นาน 60 วินาที อีก 1 รอบ แลวจึงทำปฏิกิริยา PCR ซึ่งประกอบดวย denature step 95 ํC นาน 5 วินาที annealing และ extension step ที่ 52 ํC นาน 30 วินาที จำนวน 45 รอบ

วิเคราะหที่มีความเขมขนเซลล 8E5 ระหวาง 25–600 cell/mL ตรวจวิเคราะห 10 ซ้ำ ในแตละความเขมขน โดยคา LOD คือ คาความเขมขนของเซลลที่ต่ำสุด ที่ ยังคงใหผลการทดสอบเปนบวกในทุกครั้งของการตรวจ วิเคราะหซ้ำ

การควบคุมคุณภาพและแปลผล การตรวจตัวอยางทดสอบ มีการตรวจตัวอยาง ควบคุ ม ชนิ ด บวกและชนิ ด ลบควบคู ด ว ยทุ ก ครั้ ง โดย ตัวอยางควบคุมชนิดบวกทีม่ ี HIV-1 DNA ที่ 3 copies/ reaction ต อ งพบสั ญ ญาณของการเพิ่ ม ปริ ม าณสาร พันธุกรรมของ HIV-1 LTR gene มีคา Ct ต่ำกวา 21 และพบสั ญ ญาณการเพิ่ ม ปริ ม าณสารพั น ธุ ก รรมของ human RNAseP gene มีคา Ct ต่ำกวา 13 สวนตัวอยาง ควบคุมชนิดลบ พบเฉพาะสัญญาณการเพิ่มปริมาณของ human RNAseP gene เทานัน้ ตัวอยาง DNA ทีพ่ บคา Ct ใน LTR gene และ human RNAseP gene ครบ ทั้ง 2 ยีน จะถูกแปลผลตรวจเปนบวก สวนตัวอยางตรวจ ลบจะตรวจพบเฉพาะ Ct ของยีน human RNAseP gene เทานั้น ตัวอยางที่ตรวจไมพบคา Ct ของทั้ง 2 ยีน จะรายงานผลวาตรวจวิเคราะหไมได การประเมินผลและการวิเคราะหขอมูลทางสถิติ การประเมิ น ความไวเชิ ง วิ เ คราะห (analytical sensitivity) หาขี ด จำกั ด ของการตรวจวิ เ คราะห (LOD) สำหรับการตรวจวิเคราะหเชื้อ HIV-1 วิธี real-time PCR ในชุดตัวอยางสำหรับศึกษาขีดจำกัดของการตรวจ

การประเมินความไวทางคลินกิ (clinical sensitivity) ความจำเพาะทางคลินกิ (clinical specificity) และ ความสอดคลองของวิธีการตรวจ (agreement) ประเมินความไวทางคลินกิ ความจำเพาะทางคลินกิ และความสอดคลองของการทดสอบ โดยเปรียบเทียบ การตรวจวิเคราะหเชือ้ HIV-1 ดวยวิธี real-time PCR ในตัวอยาง DBS ที่เหลือจากงานบริการกับผลอางอิง (สถานะการติดเชื้อ HIV-1 ของเด็ก) คำนวณคารอยละ ของความไว ความจำเพาะ ความสอดคลอง และระดับ ของความสอดคลองของวิธกี ารตรวจ ดวยสถิตสิ มั ประสิทธิ์ แคปปาของโคเฮน (Cohen's kappa coefficient) ทีร่ ะดับ นัยสำคัญ p < 0.05 รายละเอียดวิธีการคำนวณความไว ความจำเพาะ และความสอดคล อ งของวิ ธี ก ารตรวจ ดังแสดงในตารางที่ 2 ความไวทางคลินิก (clinical sensitivity) คือ วิธีการทดสอบแสดงผลเปนบวก เมื่อทดสอบกับตัวอยาง อางอิงที่มีสถานภาพติดเชื้อ คำนวณไดจาก %sensitivity = {a/(a+b)} × 100 ความจำเพาะทางคลินิก (clinical specificity) คือ วิธีการทดสอบแสดงผลเปนลบ เมื่อทดสอบกับตัวอยาง อางอิงที่มีสถานภาพไมติดเชื้อ คำนวณไดจาก %specificity = {d/(c+d)} × 100 ความสอดคลองของวิธีการตรวจ คือ วิธีการทดสอบ แสดงผลตรงกันกับสถานภาพของตัวอยางอางอิง คำนวณ ไดจาก %agreement = {a+d/(a+b+c+d)} × 100

ตารางที่ 2 วิธีการคำนวณความไวทางคลินิก ความจำเพาะทางคลินิก และความสอดคลองของการวิธีการตรวจ

ผลการทดสอบที่ไดจากวิธีการตรวจ

18

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

ผลบวก ผลลบ รวม

ผลอางอิง (สถานะการติดเชื้อ HIV-1 ของเด็ก) ติดเชื้อ ไมติดเชื้อ รวม a c a+c b d b+d a+b c+d a+b+c+d

การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ดวยวิธี direct DBS real-time PCR

ผล ความไวเชิงวิเคราะห (analytical sensitivity) ของการตรวจหาเชื้อ HIV-1 ดวยวิธี direct DBS real-time PCR การตรวจเซลล 8E5 ที่ ค วามเข ม ข น ระหว า ง 25-600 cells/mL พบวาขีดจำกัดของการตรวจวิเคราะห (LOD) วิธี real-time PCR โดยวิธีที่ใหบริการใน ปจจุบนั ดวยชุดน้ำยาตรวจทีพ่ ฒ ั นาขึน้ ใชเอง มี LOD อยูท ี่ 500 cells/mL หรือคิดเปน 5 DNA copies/reaction ในขณะที่วิธี direct DBS real-time PCR มี LOD อยูที่ 200 cells/mL หรือคิดเปน 0.6 DNA copies/ reaction ดังแสดงในตารางที่ 3

วิโรจน พวงทับทิม และคณะ

ความไวทางคลินกิ (clinical sensitivity) ความจำเพาะ ทางคลินกิ (clinical specificity) ความสอดคลอง ของวิธีการตรวจ (agreement) และคาสัมประสิทธิ์ แคปปาของโคเฮน (Cohen's kappa coefficient) จากตัวอยางกระดาษซับเลือดทัง้ หมด 287 ตัวอยาง เปนตัวอยางที่ติดเชื้อ HIV-1 จำนวน 88 ตัวอยาง และ ตัวอยางที่ไมติดเชื้อจำนวน 199 ตัวอยาง วิธีการตรวจ หาเชื้อ HIV-1 ดวย direct DBS real-time ใหผล การตรวจตรงกับสถานะการติดเชื้อ HIV-1 ในเด็กที่ อายุ 24 เดือน จำนวน 88 ตัวอยาง คิดเปนความไวทาง คลินกิ รอยละ 100 แตใหผลลบตรงกับสถานการณไมตดิ เชื้อ HIV-1 จำนวน 180 ตัวอยาง คิดเปนความจำเพาะ

ตารางที่ 3 ความไวในการตรวจวิเคราะห (analytical sensitivity) ของการตรวจหาเชือ้ HIV-1 real-time PCR โดยวิธีที่ใหบริการในปจจุบันดวยชุดน้ำยาตรวจที่พัฒนาขึ้นใชเองและวิธี direct DBS real-time PCR

ความเขมขนของ เซลล 8E5 ที่เจือจาง ดวยเลือด (cells/mL) 25 50 100 200 300 400 500 600

วิธีที่ใหบริการในปจจุบัน ดวยชุดน้ำยาตรวจที่พัฒนาขึ้นใชเอง

วิธี direct DBS real-time PCR

ความเขมขน DNA ความเขมขน DNA จากปริมาตรเลือด จากปริมาตรเลือด Positive % Positive % 10 μL 3 μL (n/n) positive (n/n) positive (copies/ (copies/ reaction) reaction) 0.25 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0** 6.0

0/10 0/10 0/10 4/10 6/10 8/10 10/10 10/10

0 0 0 40 60 80 100 100

0.075 0.15 0.3 0.6* 0.9 1.2 1.5 1.8

0/10 5/10 7/10 10/10 10/10 10/10 10/10 10/10

0 50 70 100 100 100 100 100

*วิธี direct DBS real-time PCR มี LOD ที่ 0.6 DNA copies/reaction หรือคิดเปนความเขมขนของเซลลท่ีติดเชื้อ 200 cells/mL **วิธี real-time PCR โดยชุดน้ำยาตรวจที่พัฒนาขึ้นเองที่ใหบริการในปจจุบัน มี LOD ที่ 5.0 DNA copies/reaction หรือคิด เปนความเขมขนของเซลลที่ติดเชื้อ 500 cells/mL

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

19

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Sample

Wiroj Puangtabtim et al.

ร อ ยละ 90.5 คิ ด เป น ค า สอดคล อ ง (agreement) รอยละ 93.4 (95% CI: 89.9-96.0) โดยมีคา สัมประสิทธิ์ แคปปาของโคเฮน (Cohen's kappa coefficient)

เทากับ 0.853 (p < 0.001) โดยพบผลบวกปลอมจำนวน 19 ตัวอยาง หรือคิดเปนรอยละ 9.5 (95% CI: 5.8-14.5) ดังแสดงในตารางที่ 4

ตารางที่ 4 ความสอดคลองของผลการตรวจหาเชื้อ HIV-1 วิธี real-time PCR โดยชุดน้ำยาตรวจที่พัฒนาขึ้นเอง ที่ใหบริการในปจจุบันและวิธี direct DBS real-time PCR ในตัวอยางสงตรวจ (clinical samples ที่ทราบสถานภาพการติดเชื้อ HIV-1 ของเด็กที่อายุ 24 เดือน วิธีการตรวจ วิธีที่ใหบริการในปจจุบันดวยชุดน้ำยา ตรวจที่พัฒนาขึ้นใชเอง วิธี direct DBS real-time PCR

สถานภาพการติดเชื้อ HIV-1 ในตัวอยางสงตรวจ (n = 287) ติดเชื้อ ไมติดเชื้อ (n = 88) (n = 199) ผลบวก 88 0 ผลลบ 0 199 ผลบวก 88* 19 ผลลบ 0 180**

*sensitivity = 100%, **specificity = 90.5%, agreement = 93.4%, kappa = 0.853 (p < 0.001)

วิจารณ จากการทดสอบดวยเซลล 8E5 ที่ใชเปนตัวแทน ของการตรวจหายีนเปาหมายของเชือ้ HIV-1 ในตัวอยาง หยดเลือดแหงที่เก็บบนกระดาษซับ น้ำยาตรวจวิเคราะห การติดเชื้อ HIV-1 วิธี direct DBS real-time PCR มีคา LOD เทากับ 200 cells/mL ดีกวาวิธีที่ใหบริการ ในป จ จุ บั น ด ว ยชุ ด น้ ำ ยาตรวจที่ พั ฒ นาขึ้ น ใช เ อง ที่ มี LOD เทากับ 500 cells/mL ซึ่งใชตัวอยาง DBS ขนาด 3 mm เพียง 1 ชิ้น หรือเทากับปริมาตรเลือดเพียง 3 μL โดยใสตวั อยางสงตรวจลงไปในน้ำยาทำ PCR ไดโดยตรง ไมตองมีกระบวนการสกัด DNA ทำใหไดสารพันธุกรรม ทั้งหมดที่มีอยูในตัวอยางนั้น ตางจากการตรวจดวยวิธี ทีใ่ หบริการในปจจุบนั ดวยชุดน้ำยาตรวจทีพ่ ฒ ั นาขึน้ ใชเอง ที่มีกระบวนการสกัดตัวอยางหลายขั้นตอน ตั้งแตการ ละลายสารพันธุกรรมออกจากกระดาษ การกำจัดสาร รบกวนปฏิกิริยา การลางทำความสะอาดและการชะสาร พันธุกรรมออกในรูปแบบสารละลายที่พรอมนำมาใชใน การทำ PCR ซึ่งอาจทำใหเกิดการสูญหายของ DNA ใน ระหวางกระบวนการดังกลาว(18)

20

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

การตรวจหาการติดเชื้อ HIV-1 วิธี direct DBS real-time PCR ในตัวอยาง clinical samples จาก เด็กที่คลอดจากแมที่ติดเชื้อ พบผลตรวจเปนบวกปลอม จากตัวอยางที่มีสถานะไมติดเชื้อ HIV-1 รอยละ 9.5 (19/199 ตัวอยาง) ในปจจุบัน วิธีที่ใหบริการดวยชุด น้ ำ ยาตรวจที่ พั ฒ นาขึ้ น ใช เ องให ผ ลตรงกั บ สถานภาพ การติดเชื้อ HIV-1 ของทุกตัวอยาง ตัวอยางที่ใหผลบวก โดย direct DBS real-time PCR ที่ ขั ด แย ง กับสถานะการติดเชื้ออาจเกิดจากขั้นตอนการทำ preamplification จำนวน 15 รอบ จากการทำ amplification จำนวน 45 รอบ จึงเหมือนกับเปนการทำปฏิกิริยา PCR ซ้ำถึง 2 ครั้ง รวม 60 รอบ ในขณะที่การทำ ปฏิกริ ยิ า PCR ดวยชุดน้ำยาตรวจทีพ่ ฒ ั นาขึน้ เอง มีการทำ amplification จำนวน 45 รอบ ครั้ ง เดี ย วเท า นั้ น ซึง่ โดยทัว่ ไปการทำ PCR มีขอ แนะนำใหทำการเพิม่ จำนวน ไมเกิน 45 รอบ(19,20) และการมีขนั้ ตอน pre-amplification อาจทำใหเกิด amplification bias เนื่องจากจะเปน การเพิ่มปริมาณสัญญานของ target gene เปนจำนวน หลายเท า (fold) จากจำนวนของ gene target

การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ดวยวิธี direct DBS real-time PCR

ที่ มี อ ยู จ ริ ง ในตั ว อย า ง ทำให เ กิ ด การอ า นผลแบบการ เป น ตั ว แทนมากเกิ น ไป (overrepresentation) ซึ่งมีแนวโนมที่ทำใหเกิดสัญญาณการอานเปนผลบวก ปลอมได(21) อยางไรก็ตามชุดน้ำยาที่มีขั้นตอนการทำ pre-amplification มี ข อ ดี ใ นกรณี ที่ ตั ว อย า งมี ส าร พันธุกรรมเปาหมายปริมาณนอยหรือจำกัด การอ า นผลการตรวจด ว ยเครื่ อ ง Mini8 Real-Time PCR System ซึง่ เปนเครือ่ งมือทีอ่ อกแบบ ให มี ค วามจำเพาะกั บ น้ ำ ยาตรวจ DirectDetect TM QRT-PCR kit ซึ่งเปนผลิตภัณฑจากผูผลิตเดียวกัน โดยตั วรั บ สั ญ ญาณแสง fluorescence (detector) เปนเทคโนโลยีและความลับของบริษัทผูผลิต ซึ่งตัวรับ สัญญาณแสงถูกออกแบบใหมีความจำเพาะและความ ไวของการตรวจจับสัญญาณ fluorescence ที่เกิดจาก ปฏิ กิ ริ ย า PCR ด ว ยน้ ำ ยาของบริ ษั ท ในระดั บ สู ง(22) ซึ่งแตกตางจากวิธีที่ใหบริการในปจจุบันดวยชุดน้ำยา ตรวจที่พัฒนาขึ้นใชเองที่ใชเครื่อง ABI 7300 RealTime PCR System ซึง่ เปนเครือ่ งมือทีใ่ ชกนั แพรหลาย โดยพบวาเมื่อใชตัวอยางที่มีความเขมขนของจำนวนยีน เป า หมายที่ เ ท า กั น เครื่ อ ง Mini8 Real-Time PCR System ใหคา Ct ต่ำกวาคาที่อานไดจากเครื่อง ABI 7300 Real-Time PCR System ประมาณ 10 cycles (ขอมูลที่ไมไดเผยแพร) ซึ่งเปนการอาน คา Ct แบบอัตโนมัติที่ไมสามารถปรับคา threshold แบบ manual ได นอกจากนี้ เครือ่ ง Mini8 Real-Time PCR System มีระบบการอานสัญญาณแสงในแนว ระนาบที่สูงกวาตำแหนงกระดาษ DBS ที่อยูกนหลอด ทำใหใชไดกับหลอดปฏิกิริยาแบบแถว (strip tube) หรือแบบหลอดที่วางในแนวแถวเดี่ยวเทานั้นและจำกัด จำนวนตั ว อย างตรวจสูงสุดไดเพียง 8 ตัว อยาง และ วิธี direct DBS real-time PCR ดวย ในขณะที่ เครื่อง ABI 7300 Real-Time PCR System มี ระบบการอ า นสั ญ ญาณแสงในแนวดิ่ ง เหมื อ นเครื่ อ ง real-time PCR ทัว่ ไป ซึง่ จะไมสามารถอานคาสัญญาณ แสง fluorescence จากวิธี direct DBS real-time PCR เพราะถูกบังดวยกระดาษ DBS ที่อยูกนหลอด

วิโรจน พวงทับทิม และคณะ

การนำวิธี direct DBS real-time PCR มาใช ในการใหบริการของสถาบันชีววิทยาศาสตรทางการแพทย ตองมีการปรับปรุงขัน้ ตอนการตรวจวิเคราะหใหเหมาะสม เชน ปรับลดรอบของการทำ amplification หรือ preamplification อาจทำใหลดโอกาสเกิดผลบวกปลอม และยังลดเวลาในการทำปฏิกิริยาใหสั้นลงไดอีก การเพิ่ ม ตั ว อย า งศึ ก ษาทางคลิ นิ ก (clinical samples) ใหเปนไปตามมาตรฐานการประเมินชุดน้ำยา ทีส่ ำนักงานคณะกรรมการอาหารและยากำหนด (ตัวอยาง ติดเชื้ออยางนอย 100 ตัวอยาง และตัวอยางไมติดเชื้อ อยางนอย 700 ตัวอยาง)(23) แมวาจากการเปรียบเทียบ กับฐานขอมูลพันธุกรรม primer/probe ที่ใชในการ ศึกษานี้มีความจำเพาะตอเปาหมาย HIV-1 LTR gene (in silico analysis) และไมจับกับยีนของเชื้ออื่นๆ (ขอมูลที่ไมไดเผยแพร) คณะผูวิจัยเห็นวาควรมีการ ศึกษาการเกิด cross reactivity ของวิธีการตรวจที่อาจ เกิดจากการติดเชื้ออื่นๆ เพิ่มเติมตอไป เชน Hepatitis B virus, Hepatitis C virus และ Dengue virus เปนตน

สรุป

วิธี direct DBS real-time PCR มีความไวใน เชิงวิเคราะหสูง เปนวิธีการที่งาย สะดวกรวดเร็ว และไมมี ขัน้ ตอนสกัดสารพันธุกรรม จึงลดเวลาการตรวจวิเคราะห มีความเปนไปไดที่จะนำมาใชตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ทางหองปฏิบัติการสำหรับเด็กที่คลอดจากแม ทีต่ ดิ เชือ้ การพัฒนาและปรับปรุงใหวธิ กี ารมีความจำเพาะ ที่สูงขึ้น รวมทั้งประเมินวิธีการตรวจดวยจำนวนตัวอยาง ตามที่ ส ำนั ก งานคณะกรรมการอาหารและยากำหนด ในเรื่องชุดตรวจที่เกี่ยวของกับการติดเชื้อเอชไอวี ซึ่ง กำหนดเกณฑการทดสอบหรือวิเคราะหชุดตรวจที่ตรวจ หากรดนิวคลิอกิ เพือ่ การวินจิ ฉัยรายบุคคล กำหนดเกณฑ ความไวเชิงวิเคราะหที่ 100% ของจำนวนตัวอยางไมนอย กวา 100 ตัวอยาง และความจำเพาะเชิงวินิจฉัยที่ 99.5% ของจำนวนตัวอยาง ไมนอ ยกวา 700 ตัวอยาง(23) จะทำให สามารถนำวิ ธี ก ารนี้ ม าใช ใ นการให บ ริ ก ารได ต อ ไป ในอนาคต

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

21

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Sample

Wiroj Puangtabtim et al.

กิตติกรรมประกาศ การศึ ก ษาครั้งนี้ไดรับทุนสนับสนุนจากสถาบัน ชี ว วิ ท ยาศาสตร ท างการแพทย กรมวิ ท ยาศาสตร การแพทย กระทรวงสาธารณสุ ข และขอขอบคุ ณ ศู น ย บ ริ ก ารโลหิ ต แห ง ชาติ สภากาชาดไทย ที่ ใ ห การสนับสนุนตัวอยางโลหิตบริจาคผูไมติดเชื้อ สถาบัน สุขภาพเด็กแหงชาติ รวมทั้งโรงพยาบาลทั่วไปที่สงตรวจ ตัวอยางตรวจการติดเชื้อ HIV-1 ในเด็กที่คลอดจากแม ที่ติดเชื้อในการใหขอมูลสถานะการติดเชื้อของเด็กที่ใช ในการศึกษานี้

ผลประโยชนทับซอน การศึ ก ษาวิ จั ย นี้ สถาบั น ชี ว วิ ท ยาศาสตร ท าง การแพทย กรมวิทยาศาสตรการแพทย ไมไดมผี ลประโยชน ทับซอน (conflict of interest) ที่เปนสวนไดสวนเสีย หรือ การรับทุนสนับสนุนการวิจยั จากน้ำยาบริษทั KAPA Probe Fast qPCR kit (KAPA Biosystems, MA, USA) และ น้ำยาบริษัท DirectDetectTM QRT-PCR kit (Coyote Bioscience, Beijing, China) ที่ไดนำ มาใชในการศึกษานี้

4.

5.

6.

7.

8.

เอกสารอางอิง 1. Luo W, Yang H, Rathbun K, Pau CP, Ou CY. Detection of human immunodeficiency virus type 1 DNA in dried blood spots by a duplex real-time PCR assay. J Clin Microbiol 2005; 43(4): 1851-7. 2. วิโรจน พวงทับทิม, หรรษา ไทยศรี, รัชณีกร ใจซื่อ, สุพรรณี กงแกว, ปนทอง นะบาล, นวลจันทร วิจักษณ จินดา และคณะ. การเปรียบเทียบประสิทธิภาพของ ชุ ด น้ํ า ยาสํ า หรั บ การตรวจหาเชื้ อ เอชไอวี - 1 ด ว ยวิ ธี real-time PCR. เอกสารประกอบการประชุมวิชาการ วิทยาศาสตรการแพทย ครัง้ ที่ 21. วันที่ 16-18 มิถนุ ายน 2556. โรงแรมเซ็นทาราศูนยราชการและคอนเวนชัน เซ็นเตอร กรุงเทพมหานคร. นนทบุร:ี กรมวิทยาศาสตร การแพทย กระทรวงสาธารณสุข; 2556. 3. หรรษา ไทยศรี, พงษนุวัฒน ศรีงาม, อาชวินทร โรจน วิวัฒน, รัชณีกร ใจซื่อ, สุธน วงษชีรี. การเปรียบเทียบ

22

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

9.

10.

11. 12.

ประสิทธิภาพการตรวจวินจิ ฉัยการติดเชือ้ เอชไอวี-1 วิธี พีซอี าร ระหวางชุดน้าํ ยาผลิตใชเอง กับชุดน้าํ ยาสําเร็จรูป Amplicor HIV-1 test. ว วิชาการสาธารณสุข 2549; 15(2): 215-24. World Health Organization. WHO recommendations on the diagnosis of HIV infection in infants and children. Genève, Switzerland: World Health Organization; 2010. Smit PW, Elliott I, Peeling RW, Mabey D, Newton PN. An overview of the clinical use of filter paper in the diagnosis of tropical diseases. Am J Trop Med Hyg 2014; 90(2): 195-210. Jani IV, Meggi B, Mabunda N, Vubil A, Sitoe NE, Tobaiwa O, et al. Accurate early infant HIV diagnosis in primary health clinics using a point-of-care nucleic acid test. J Acquir Immune Defic Syndr 2014; 67(1): e1-4. Sidstedt M, Hedman J, Romsos EL, Waitara L, Wadsö L, Steffen CR, et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Anal Bioanal Chem 2018; 410(10): 2569-83. Nishimura N, Nakayama T, Tonoike H, Kojima K, Kato S. Direct polymerase chain reaction from whole blood without DNA isolation. Ann Clin Biochem 2000; 37(Pt 5): 674-80. Mercier B, Gaucher C, Feugeas O, Mazurier C. Direct PCR from whole blood, without DNA extraction. Nucleic Acids Res 1990; 18(19): 5908. Carpi FM, Di Pietro F, Vincenzetti S, Mignini F, Napolioni V. Human DNA extraction methods: patents and applications. Recent Pat DNA Gene Seq 2011; 5(1): 1-7. Grunenwald H. Direct PCR from dried blood without DNA extraction using the Failsafe™ PCR system. Epicenter Forum 2001; 8: 4-6. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009; 55(4): 611-22.

การตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV-1 ดวยวิธี direct DBS real-time PCR 13. สํานักโรคเอดส วัณโรค และโรคติดตอทางเพศสัมพันธ กรมควบคุมโรค กระทรวงสาธารณสุข. แนวทางการ ตรวจรักษาและปองกันการติดเชื้อเอชไอวีประเทศไทย ป 2560. กรุงเทพฯ: โรงพิมพชุมนุมสหกรณการเกษตร แหงประเทศไทยจํากัด; 2560. 14. Lolekha R, Boonsuk S, Plipat T, Martin M, Tonputsa C, Punsuwan N, et al. Elimination of mother-to-child transmission of HIV - Thailand. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2016; 65(22): 562-6. 15. Naiwatanakul T, Voramongkol N, Punsuwan N, Lolekha R, Gass R, Thaisri H, et al. Uptake of early infant diagnosis in Thailand’s national program for preventing mother-to-child HIV transmission and linkage to care, 2008-2011. J Int AIDS Soc 2016; 19(1): 20511. (9 pages). 16. Mei JV, Zobel SD, Hall EM, De Jesús VR, Adam BW, Hannon WH. Performance properties of filter paper devices for whole blood collection. Bioanalysis 2010; 2(8): 1397-403. 17. Mei JV, Alexander JR, Adam BW, Hannon WH. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr 2001; 131(5): 1631S-6S.

วิโรจน พวงทับทิม และคณะ

18. Rohland N, Hofreiter M. Comparison and optimization of ancient DNA extraction. Biotechniques 2007; 42(3): 343-52. 19. Kadri K. Polymerase chain reaction (PCR): principle and applications. In: Synthetic Biology-New Interdisciplinary Science. London: IntechOpen; 2020. p. 147-163. 20. Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp 2012; (63): e3998. (15 pages). 21. Okino ST, Kong M, Sarras H, Wang Y. Evaluation of bias associated with highmultiplex, target-specific pre-amplification. Biomol Detect Quantif. 2016; 6: 13-21. 22. Zhang XA, Li S, Ching J, Feng HY, Yang K, Dolinger DL, et al. A sensitive and specific point-of-care detection assay for Zaire Ebola virus. Emerg Microbes Infect 2017; 6(1): e5. (3 pages). 23. ประกาศกระทรวงสาธารณสุข เรื่อง ชุดตรวจที่เกี่ยวของ กับการติดเชือ้ เอชไอวี. ราชกิจจานุเบกษา เลม 126 ตอน พิเศษ 179 ง. (วันที่ 14 ธันวาคม 2552). หนา 17.

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

23

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Sample

Wiroj Puangtabtim et al.

HIV-1 Diagnosis from Direct Dried Blood Spot Samples Using real-time PCR Wiroj Puangtabtim,1 Ratchaneekorn Jaisue,1 Nuanjun Wichukchinda,2 and Archawin Rojanawiwat3 Medical Life Sciences Institute, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand 2 Medical Sciences Technical Office, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand 3 National Institute of Health, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand 1

ABSTRACT Perinatal HIV-1 diagnostic testing by real-time PCR using a dried blood spot (DBS)

sample is easily accessible for service delivery. We proposed a novel method, using DBS samples without DNA extraction (direct DBS real-time PCR), which is convenient and less time-consuming. A comparison between the new method using Coyote Bioscience reagent and the current one using KAPA Probe Fast reagent with DNA extraction was performed with the same set of primer/probe. Limit of detection (LOD) was determined by using 8E5 cell line, while clinical sensitivity and specificity were done on 287 leftover DBS specimens sent to the Medical Life Science Institute, Department of Medical Sciences, during 2016 to 2018. Of all the leftover samples, 88 were HIV-1 infected and 199 were non-infected. The LOD of the direct DBS real-time PCR and the current assays were 200 and 500 cells/mL of blood, respectively. The novel method had 100% (88/88) sensitivity and 90.5% (180/199) specificity with 93.4% (268/287) concordant results at kappa score 0.853 (p < 0.001). This study showed that the direct DBS real-time PCR was not only less time-consuming, but also more sensitive (lower LOD) than the currently used method. However, optimization to raise the specificity to be higher than 99.5% as per the Thai FDA criteria is needed for use in routine services. Keywords: HIV-1 diagnosis, real-time PCR, direct dried blood spot samples

24

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

นิพนธตนฉบับ

ว กรมวิทย พ 2565; 64 (1): 25-47

การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยัง้ การทำงานของเอนไซมไทโรซีนไคเนส เพือ่ คนหาสารตานมะเร็ง ภาณุพันธ ปญญาใจ ปฐมาพร ปรึกษากร พันธธิดา ตรียวง ฉัตรภรณ ใจมา และ ปนัดดา เทพอัคศร สถาบันชีววิทยาศาสตรทางการแพทย กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000

บทคัดยอ ไทโรซีนไคเนสมีบทบาทสําคัญในการสงสัญญาณตางๆ ภายในเซลล ซึ่งเกี่ยวของกับการเจริญ การแพรกระจาย

การลุกลาม และการสรางหลอดเลือดใหมของเซลลมะเร็ง โปรตีนกลุมนี้หลายชนิดใชในการรักษามะเร็งแบบมุงเปา การศึกษานี้ มีวตั ถุประสงคเพือ่ พัฒนาระบบทดสอบสําหรับคัดกรองสารยับยัง้ การทํางานของไทโรซีนไคเนสจากตัวอยางสารจํานวนมาก คณะ ผูวิจัยไดพัฒนาระบบทดสอบ โดยเริ่มจากการศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวของกับโปรตีนกลุมนี้ในเซลลมะเร็งเพาะเลี้ยง 4 ชนิด ดวยวิธี quantitative real-time PCR รวมทั้งวัดระดับการทํางานของไทโรซีนไคเนสใน cell lysate แตละชนิดดวย วิธี ELISA เพื่อคัดเลือกเซลลที่เหมาะสม คัดเลือกเซลล HeLa สําหรับพัฒนาระบบทดสอบ จากนั้นศึกษาสภาวะที่เหมาะสม พบวาปริมาณ cell lysate 0.125 mg/mL peptide substrate 0.25 µg ตอหลุม ATP 25 nM และเวลาในการทําปฏิกิริยา 30 นาที เหมาะสมสําหรับการทําปฏิกิริยาไคเนส เมื่อทดสอบระบบที่พัฒนาดวยสารที่มีฤทธิ์ยับยั้งมะเร็ง พบวาสารกลุมที่มี ฤทธิ์ยับยั้งการทํางานของไทโรซีนไคเนสลดคาสัญญาณในระบบได ทดสอบความใชไดของระบบโดยวิเคราะหความแปรปรวน ของคาสัญญาณ พบวาพารามิเตอรทุกคาผานเกณฑการยอมรับ แสดงใหเห็นวาระบบทดสอบนี้สามารถทําซ้ําไดและเหมาะสม สําหรับใชทดสอบสาร คณะผูวิจัยยังนําระบบทดสอบดังกลาวทดสอบฤทธิ์กับสารสกัดสมุนไพร 180 ตัวอยาง และตรวจสอบ ยืนยันฤทธิ์อีกครั้งดวยวิธี MTT assay และ transmembrane assay พบสารที่แสดงฤทธิ์ตานมะเร็งในเซลลเพาะเลี้ยงจริง ระบบทดสอบที่พัฒนาขึ้นจึงเหมาะสมเปนระบบทดสอบสําหรับคัดกรองสารยับยั้งการทํางานของเอนไซมไทโรซีนไคเนส คําสําคัญ: มะเร็ง, ระบบทดสอบสําหรับคัดกรองสารยับยั้งเอนไซมไทโรซีนไคเนส, สารยับยั้งการทํางานของไทโรซีนไคเนส, เปาหมายยาตานมะเร็ง

Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 25 October 2021 Revised: 5 Feburaury 2022

Accepted: 7 Feburaury 2022

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

25

Development of Tyrosine Kinase Inhibitor Screening Assay

บทนํา โรคมะเร็งเปนปญหาสาธารณสุขที่สำคัญของโลก ในป พ.ศ. 2563 ประมาณการวามีผเู สียชีวติ ดวยโรคมะเร็ง จำนวน 10 ลานคน และมีผูปวยเปนโรคมะเร็งเพิ่มขึ้น จำนวน 19.3 ลานคน โดยในป พ.ศ. 2583 คาดการณวา จะมี ผูปวยเปนโรคมะเร็งเพิ่มขึ้นเปนประมาณ 28.4 ลานคน ตอป(1) สำหรับประเทศไทยโรคมะเร็งเปนสาเหตุการเสียชีวติ อันดับ 1 ติดตอกันหลายป ในป พ.ศ. 2562 มีผูเสียชีวิต ดวยโรคมะเร็ง 84,073 คน โดยมีอตั ราการตาย 128.2 คน ตอประชากร 100,000 คน(2) การรักษามะเร็งทำไดโดย การผาตัด การฉายรังสี และการใชวิธีเคมีบำบัด แพทย อาจพิ จ ารณารั ก ษาด ว ยวิ ธี เ ดี ย วหรื อ หลายวิ ธี ร ว มกั น การรักษาในปจจุบนั ยังพบปญหาการกลับเปนซ้ำ การดือ้ ยา และการเกิดอาการไมพึงประสงคเนื่องจากยาเคมีบำบัด ไมออกฤทธิ์จำเพาะกับเซลลมะเร็ง ทำลายเซลลปกติของ รางกาย(3) การพัฒนายาที่มีประสิทธิผลดีและมีความ จำเพาะตอเปาหมายจึงยังเปนที่ตองการสำหรับโรคนี้ ไทโรซีนไคเนส (tyrosine kinases) เปนเอนไซม (enzyme) ชนิ ด หนึ่ ง ที่ เ ป น กุ ญ แจสำคั ญ ในการส ง สัญญาณเพือ่ ควบคุมกระบวนการตางๆ ภายในเซลล เชน การเจริญ การเพิ่มจำนวน การเคลื่อนที่ และการเปลี่ยน รูปราง โปรตีนชนิดนีท้ ำหนาทีถ่ า ยโอนหมูฟ อสเฟตตัวทาย (γ phosphate group) จาก adenosine triphosphate (ATP) ไปยังโปรตีนเปาหมายที่ตำแหนงไทโรซีน แบง เปน 2 กลุม คือ กลุมที่เปนตัวรับ (receptor tyrosine kinase: RTK) และกลุม ทีไ่ มเปนตัวรับ (non-receptor tyrosine kinase: NRTK) ภาพรวมกระบวนการสง สัญญาณของไทโรซีนไคเนสกลุม RTK เริ่มจากลิแกนด (ligand) จับกับ RTK สวนทีย่ นื่ อยูน อกเซลล ทำให RTK เขาคูก นั ในรูปแบบไดเมอร (dimerization) และกระตุน ใหเกิดการเติมหมูฟอสเฟตระหวางกัน (autophosphorylation) ที่ kinase domain ซึ่งอยูภายในเซลล จากนั้น RTK จะเริ่มสงสัญญาณโดยดึงหมูฟอสเฟตจาก ATP และถายโอนไปยังโปรตีนอืน่ (phosphorylation) ที่เกี่ยวของกับวิถีการสงสัญญาณ ซึ่งสงผลตอการตอบ สนองของเซลลตอไป การสงสัญญาณของไทโรซีนไคเนส กลุม NRTK มีลักษณะคลายคลึงกัน โดยเมื่อ NRTK

26

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Parnuphan Panyajai et al.

ถูกกระตุนจะเกิด autophosphorylation หรือเกิด phosphorylation โดย NRTK ชนิดอื่นกอนจะเริ่ม ส ง สั ญ ญาณ การแสดงออกที่ ม ากเกิ น ไปของโปรตี น หลายชนิ ด ในกลุ ม นี้ เ กี่ ย วข อ งกั บ การเจริ ญ เติ บ โต การแพรกระจาย การลุกลาม และการกระตุนการสราง หลอดเลือดใหมในเซลลมะเร็ง(4,5) โปรตีนกลุมนี้จึงเปน เปาหมายในการพัฒนายา เชน EGFR (epidermal growth factor receptor หรือ ErbB-1), HER2 (human epidermal growth factor receptor 2 หรื อ ErbB-2), c-Met (hepatocyte growth factor receptor: HGFR) และ c-Kit (protooncogene receptor tyrosine kinase) เปนตน ยาที่จำเพาะตอเปาหมายเหลานี้ไดรับการขึ้นทะเบียน ในหลายประเทศแล ว (6,7) แต ยั ง พบป ญ หาการดื้ อ ยา และการเกิดอาการไมพึงประสงค(6,7) ดังนั้น การคนหา สารยั บ ยั้ ง การทำงานของไทโรซี น ไคเนส (tyrosine kinase inhibitors) เพื่อพัฒนายาใหมที่ออกฤทธิ์ ครอบคลุมโปรตีนเปาหมายหลายชนิด มีประสิทธิผลดี และมีผลขางเคียงนอยจึงมีความสำคัญ การวิเคราะหระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนส เพื่ อ ค น หาสารที่ มี ฤ ทธิ์ ยั บ ยั้ ง การทำงานของโปรตี น ดังกลาวนั้น แตเดิมใชวิธี filtration assay (FA) ซึ่งใช [γ-32P] ATP ในการทำปฎิกิริยา และกรองแยกเปปไทด ที่ถูกเติมหมูฟอสเฟต กอนจะตรวจวัดปริมาณดวยเครื่อง วัดรังสีแบบซินทิลเลชั่น (scintillation counter)(8) วิธนี ที้ ำใหเกิดของเสียทีป่ ระกอบดวยสารกัมมันตรังสี และ ไมเหมาะสมกับการทดสอบกับสารตางๆ จำนวนมากจาก คลังสารเคมี (compound library) จึงมีการพัฒนาวิธี วิเคราะหระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนสดวยวิธีการ หรือหลักการอื่น เชน วิธี scintillation proximity assay (SPA) ซึ่งใช [γ-33P] ATP แทน [γ-32P] ATP เนื่ อ งจากมี ค วามเสถี ย รมากกว า และวิ เ คราะห ร ะดั บ การทำงานของไทโรซี น ไคเนสจากโฟตอนที่ ถู ก ปล อ ย ออกมาจากการจับตัวกันของเปปไทดที่เชื่อมกับไบโอติน (biotinylated peptide) กับเม็ดบีดหรือไมโครเพลททีม่ ี scintillant (9,10) นอกจากนี้ ยั ง มี วิ ธี fluorescence polarization (FP) ซึ่งใชระดับการบิดระนาบของแสง

การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งไทโรซีนไคเนส

(polarization) ในการตรวจวิเคราะห(11) วิธี fluorescence resonance energy transfer (FRET) ซึ่ง วิเคราะหจากความเขมขนของการเรืองแสงที่เกิดจาก การถ า ยทอดพลั ง งานระหว า งโมเลกุ ล (12) และวิ ธี luciferase-based ATP detection ซึ่ ง วั ด ระดั บ การทำงานของไทโรซี น ไคเนสจากปริ ม าณ ATP ที่ เหลื อ ในระบบโดยเอนไซม luciferase (13) วิ ธี ต รวจ วิเคราะหขางตนมีขอจำกัด เชน วิธี FA จำเปนตองใช สารกัมมันตรังสี จึงตองปฏิบัติงานในหองปฏิบัติการ เฉพาะเท า นั้ น วิ ธี FP ให ค า สั ญ ญาณวิ เ คราะห ต อ สัญญาณรบกวน (signal-to noise ratio: S/N) ต่ำ และไมเหมาะกับการทดสอบกับสารทีม่ คี วามเขมขนสูง วิธี FRET และ luciferase-based ATP detection เปน การวัดปฏิกริ ยิ าโดยออมและอาจถูกรบกวนจากสารยับยัง้ protease หรือ luciferase ซึ่งเปนเอนไซมที่ใชในระบบ ทดสอบดังกลาว ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) เปนอีกเทคนิคหนึ่งที่ถูกนำมาใชในการตรวจ วัดระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนส วิธีที่ใชเทคนิคนี้ จะใชแอนติบอดีที่จำเพาะตอไทโรซีนที่ถูกเติมหมูฟอสเฟต (phosphotyrosine) ในการตรวจวิเคราะห(14-18) ซึง่ สะดวก และสามารถปฏิบตั ไิ ดในหองปฏิบตั กิ ารทัว่ ไป แตสว นใหญ มักใชไทโรซีนไคเนสทีบ่ ริสทุ ธิซ์ งึ่ มีราคาสูงและมักจำเพาะ ตอไทโรซีนไคเนสชนิดหนึ่งๆ เทานั้น การศึกษานี้จึงมี วัตถุประสงคเพื่อพัฒนาระบบทดสอบสำหรับวิเคราะห ระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนสดวยเทคนิค ELISA โดยศึ ก ษาการแสดงออกของยี น กลุ ม ไทโรซี น ไคเนส ในเซลล เ พาะเลี้ ย งเพื่ อ คั ด เลื อ กเซลล สำหรั บ พั ฒ นา ระบบทดสอบ หาสภาวะที่ เ หมาะสมสำหรั บ ปฏิ กิ ริ ย า ทดสอบความใช ไ ด ข องระบบและทดลองใช กั บ สาร จำนวนมาก ให ไ ด ร ะบบทดสอบสำหรั บ คั ด กรอง (screening assay) ที่สะดวก ประหยัดตนทุน และ ครอบคลุมไทโรซีนไคเนสหลายชนิด สำหรับเปนทางเลือก ในการประยุกตใชเพื่อคนหาสารที่มีฤทธิ์ยับยั้งไทโรซีนไคเนสจากสารจำนวนมาก เพือ่ นำไปศึกษาและพัฒนาเปน ยารักษามะเร็งตอไป

ภาณุพันธ ปญญาใจ และคณะ

วัสดุและวิธีการ เซลลเพาะเลี้ยง เซลลมะเร็งปากมดลูกเพาะเลี้ยง HeLa (CLS, Germany) เซลลมะเร็งตับเพาะเลี้ยง PLC/PRF/5 (CLS, Germany) และเซลลมะเร็งเตานมเพาะเลี้ยง MCF-7 (CLS, Germany) เลี้ยงในอาหาร MEM (Gibco, USA) ที่เสริมดวย 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, USA) และ 2 mM L-glutamine (Sigma-Aldrich, USA) เซลลมะเร็งทอน้ำดีเพาะเลีย้ ง KKU-100 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, Japan) เลี้ยงในอาหาร DMEM (Gibco, USA) ที่เสริมดวย 10% FBS บมที่ อุณหภูมิ 37 ํC ภายใตสภาวะ CO2 5% สารสกัดและพืชสมุนไพร ตัวอยางสารสกัดสมุนไพรที่ใชในการทดสอบเปน ตัวอยางจากคลังสารสกัดสมุนไพรของสถาบันชีววิทยาศาสตร ท างการแพทย กรมวิ ท ยาศาสตร ก ารแพทย โดยเป น สารสกั ด เอทานอล จำนวน 180 ตั ว อย า ง จากพืช 120 ชนิด ดังแสดงในตารางที่ 1 การเตรียม สารสกัดโดยตัดชิ้นสวนของตัวอยางพืชใหมีขนาดเล็ก และผึ่งใหแหงที่อุณหภูมิหอง นำชิ้นสวนพืชแหงที่ได หมักดวยเอทานอล 95% เปนเวลา 24 ชั่วโมง กรองและ หมักซ้ำอีก 24 ชั่วโมง นำสารที่กรองไดไประเหยแหง ภายใตสุญญากาศ จากนั้นเตรียมตัวอยาง โดยละลายสาร สกัดทีไ่ ดดว ย absolute ethanol ใหไดความเขมขน 0.3, 1, 3 และ 10 mg/mL สำหรับตัวอยางพืชทีแ่ สดงฤทธิท์ ี่ IC50 100 50.44±1.64 > 100 1.71±0.50 19.58±0.17 99.97±0.04 86.57±11.77

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งไทโรซีนไคเนส

วิจารณ ระบบทดสอบฤทธิ์เปนปจจัยหนึ่งที่มีความสำคัญ ในการพัฒนายา การเลือกใชระบบทดสอบที่เหมาะสม จะชวยใหคนพบสารออกฤทธิ์ที่อาจนำไปพัฒนาตอยอด เปนสารตนแบบทางยาได ระบบทดสอบที่ดีสำหรับการ ทดสอบฤทธิ์เบื้องตน ควรตรวจวัดฤทธิ์ทางเภสัชวิทยา ที่สนใจได ทำซ้ำได มีความคงทนตอสารเคมี มีคุณภาพ และประหยัดตนทุน(28) การวิเคราะหระดับการทำงาน ของไทโรซี น ไคเนส เพื่ อ ค น หาสารที่ มี ฤ ทธิ์ ยั บ ยั้ ง การ ทำงานของโปรตี น ดั ง กล า วนั้ น ทำได ห ลายหลั ก การ ซึ่ง ELISA เปนหลักการหนึ่งที่ถูกนำมาใชพัฒนาระบบ ทดสอบ ระบบทดสอบหลักการ ELISA นั้นงายและ สามารถปฏิบัติไดในหองปฏิบัติการทั่วไป มีทั้งรูปแบบ ที่ใชเซลล (cell-based assay)(14,15) และรูปแบบที่ใช ปฏิกริ ยิ าทางชีวเคมี (biochemical assay)(16-18) อยางไร ก็ตามยังมีขอจำกัด ระบบทดสอบที่ใชเซลลตองทดสอบ สารกับเซลลในแตละหลุมของไมโครเพลทกอน แลว จึงเตรียม cell lysate และถายไปยังอีกไมโครเพลทหนึ่ง เพือ่ วิเคราะหการทำงานของไทโรซีนไคเนส แตผลของสาร ทดสอบอาจทำใหเซลลในแตละหลุมมีจำนวนมากนอย ตางกัน การจะควบคุมใหมีความเขมขนเทากันจึงเปน เรื่องยาก สวนระบบทดสอบที่ใชปฏิกิริยาทางชีวเคมีมัก ใชโปรตีนที่บริสุทธิ์ซึ่งมีราคาสูง และจำเพาะตอไทโรซีนไคเนสชนิดหนึ่งๆ เทานั้น ระบบทดสอบที่พัฒนาขึ้นนี้ ไมจำเปนตองใชโปรตีนที่บริสุทธิ์ ไมจำเพาะกับโปรตีน ชนิดใดชนิดหนึ่ง และไมมีความยุงยากในการควบคุม ความเขมขนของ cell lysate จึงอาจเปนทางเลือกหนึ่ง สำหรับใชในการคัดกรองสารทีม่ ฤี ทธิย์ บั ยัง้ การทำงานของ ไทโรซีนไคเนสได การศึ ก ษานี้ เ ลื อ กศึ ก ษาการแสดงออกของยี น EGFR, HER2, MET และ KIT ในเซลล ม ะเร็ ง เพาะเลี้ยงชนิดตางๆ เพื่อคัดเลือกเซลลสำหรับพัฒนา ระบบทดสอบ เนื่องจากยีนทั้งสี่ชนิดเปนยีนของโปรตีน กลุม ไทโรซีนไคเนสทีเ่ ปนเปาหมายการรักษา และมียาทีไ่ ดรบั การขึ้นทะเบียนจากองคการอาหารและยา สหรัฐอเมริกา แลว(6,7) ผลการศึกษาพบวาเซลลเพาะเลี้ยงชนิดมะเร็ง ปากมดลูก (HeLa), มะเร็งตับ (PLC/PRF/5), มะเร็ง ทอน้ำดี (KKU-100) และมะเร็งเตานม (MCF-7)

ภาณุพันธ ปญญาใจ และคณะ

มีการแสดงออกของยีนกลุมนี้ทั้งหมด ซึ่งสอดคลองกับ การศึกษาที่พบวาเซลลมะเร็งจากคนไขมีการแสดงออก ของโปรตีนของยีนกลุม ดังกลาว(29-31) สำหรับการตรวจวัด ระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนสของเซลลมะเร็งเพาะ เลี้ยงทั้งสี่ชนิด พบวาเซลล HeLa ใหคาสัญญาณสูงสุด สอดคลองกับผลการศึกษาการแสดงออกของยีน ซึง่ พบวา เซลล HeLa มีการแสดงออกของยีนทัง้ สีช่ นิดสูงกวาเซลล อื่นโดยภาพรวม อยางไรก็ตามเนื่องจากระบบทดสอบ ที่พัฒนาขึ้นไมจำเพาะกับโปรตีนไทโรซีนไคเนสชนิดใด ชนิดหนึ่ง คาสัญญาณที่เกิดขึ้นจึงอาจเกิดจากการทำงาน ของไทโรซีนไคเนสชนิดอื่นที่พบในเซลล HeLa รวมดวย เชน Janus kinase (JAK), focal adhesion kinase (FAK), platelet-derived growth factor receptors (PDGFR) และ fibroblast growth factor receptors (FGFR) เปนตน(32) การหาสภาวะที่เหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาไคเนส พบวาการเพิ่มความเขมขนของ cell lysate, peptide substrate และ ATP ทำใหคาสัญญาณจากการตรวจ วัดระดับการทำงานของไทโรซีนไคเนสเพิ่มขึ้น เมื่อเพิ่ม ความเขมขนถึงระดับหนึ่ง คาสัญญาณจะเริ่มคงที่ แสดง ใหเห็นถึงปริมาณที่มากเกินพอ ซึ่งอาจสงผลกระทบตอ การทดสอบฤทธิ์สาร การเลือกความเขมขนที่เหมาะสม จึงควรเลือกความเขมขนทีย่ งั อยูใ นระยะเอกซโพเนนเชียล (exponential phase) และทำใหไดคาสัญญาณที่สูง เพียงพอ การศึกษานีจ้ งึ เลือก cell lysate 0.125 mg/mL, peptide substrate 0.25 µg ตอหลุม และ ATP 25 nM ในการทำปฏิกิริยา สำหรับการหาระยะเวลาที่เหมาะสม พิจารณาดวยหลักการเดียวกัน เพื่อไมใหระบบทดสอบ ที่พัฒนาขึ้นใชเวลามากเกินไป จึงเลือกใชเวลา 30 นาที ในการทำปฏิกริ ยิ า เนือ่ งจากใหคา สัญญาณทีส่ งู และใหคา Z ′ factor ที่ ใ กล เ คี ย งกั บ การทำปฏิ กิ ริ ย า 60 นาที ซึ่งสภาวะที่ไดนี้อาจแตกตางจากระบบทดสอบลักษณะ เดียวกันในการศึกษาอื่น(16-18, 21) เนื่องจากเซลล โปรตีน หรือซับสเตรตที่ใชตางกัน การศึ ก ษานี้ ไ ด ท ดสอบความคงทนของระบบ ทดสอบทีพ่ ฒ ั นาขึน้ ตอตัวทำละลายทีน่ ยิ มใชในการละลาย สารทดสอบ ไดแก เอทานอลและ DMSO เนื่องจาก สารละลายทัง้ สองชนิดมีคณ ุ สมบัตทิ ำใหโปรตีนตกตะกอน วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

41

Development of Tyrosine Kinase Inhibitor Screening Assay

หรือเสียสภาพ(33,34) จึงอาจสงผลกระทบตอเอนไซมใน ปฏิ กิ ริ ย าไคเนส ผลการทดสอบพบว า สารละลายทั้ ง สองชนิ ด จะทำให ค า สั ญ ญาณลดลงอย า งมี นั ย สำคั ญ ตั้งแตความเขมขน 6% และ 8% ตามลำดับ โดยทั่วไป การทดสอบฤทธิข์ องสารมักมีสารละลายในสัดสวน 0.1% ถึง 5%(34) จึงแสดงใหเห็นวาระบบทดสอบที่พัฒนาขึ้น มีความคงทนตอตัวทำละลายทั้งสองชนิด การศึกษานี้ ยังไดตรวจสอบความถูกตองของระบบทดสอบโดยใช สารที่มีฤทธิ์ยับยั้งมะเร็ง ผลการศึกษาพบวาสารกลุมที่ มีฤทธิ์ยับยั้งไทโรซีนไคเนสทั้งหมดลดคาสัญญาณของ ระบบ ขณะที่สารที่มีฤทธิ์ยับยั้งมะเร็งดวยกลไกอื่นไมลด คาสัญญาณโดยรวม จึงแสดงใหเห็นวาระบบทดสอบ ที่ พั ฒ นาขึ้ น สามารถใช ใ นการตรวจสอบฤทธิ์ ยั บ ยั้ ง การทำงานของไทโรซีนไคเนสได อยางไรก็ตามพบการ ลดลงของคาสัญญาณเล็กนอยจากการทดสอบสารทีม่ ฤี ทธิ์ ยับยั้งมะเร็งดวยกลไกอื่นที่ความเขมขน 100 µg/mL ซึ่งอาจเกิดจากปริมาณสารที่มากเกินไปรบกวนการทำ ปฏิกริ ยิ า ระบบทดสอบนีจ้ งึ อาจมีขอ จำกัดในกรณีทดสอบ กับสารที่มีความเขมขนมากเกินไป การศึ ก ษานี้ ใ ช Z ′ factor เป น พารามิ เ ตอร หลักในการตรวจสอบคุณภาพและความใชไดของระบบ โดย Z′ factor เปนพารามิเตอรที่แสดงชวงความกวาง ของคาสัญญาณ ระบบทดสอบที่มีคา Z′ factor ตั้งแต 0.5 ขึ้ น ไปถื อ ว า เป น ระบบทดสอบที่ ดี (23) จึ ง ใช ค า นี้ ในการกำหนดเกณฑการยอมรับ นอกจากนีย้ งั ใช %CV และ SD เพือ่ ตรวจสอบความแปรปรวนของคาสัญญาณ และใช ผลตางของคา %inhibition ตรวจสอบความแตกตางของ การทดสอบระหวางไมโครเพลทและระหวางวัน(22) ผล การศึ ก ษาพบว า ค า พารามิ เ ตอร ทุ ก ค า ผ า นเกณฑ ก าร ยอมรั บ จึ ง แสดงให เ ห็ น ว า ระบบทดสอบที่ พั ฒ นามี คุณภาพและสามารถทำซ้ำได การทดสอบกับตัวอยางสารสกัดสมุนไพรจำนวน 180 ตัวอยาง จากพืช 120 ชนิด พบสารสกัด 5 ชนิด แสดงฤทธิ์ยับยั้งการทำงานของไทโรซีนไคเนสที่ IC50 < 100 µg/mL คือ ทับทิม วานหอมแดง มะยม น้ำนมราชสีห และพลู เนือ่ งจากระบบทดสอบทีพ่ ฒ ั นาเปนระบบทดสอบ สำหรั บ คั ด กรองเบื้ อ งต น และใช ป ฏิ กิ ริ ย าทางชี ว เคมี ในการทดสอบ อาจถูกรบกวนจากสารอื่น เชน สารที่มี

42

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Parnuphan Panyajai et al.

คุณสมบัติท ำใหโปรตีนเสื่อมสภาพ จึงมีความจำเป น ต อ งตรวจสอบยื น ยั น ฤทธิ์ ต า นมะเร็ ง ในเซลล ม ะเร็ ง เพาะเลี้ ย งอี ก ครั้ ง เนื่ อ งจากไทโรซี น ไคเนสเกี่ ย วข อ ง กับกระบวนการเจริญ และการแพรกระจายของเซลล มะเร็ ง การศึ ก ษานี้ จึ ง เลื อ กที่ จ ะศึ ก ษาฤทธิ์ ยั บ ยั้ ง การ เจริญและฤทธิ์ยับยั้งการแพรกระจายของเซลลมะเร็ง ของสารสกัดทั้ง 5 ชนิด เพื่อตรวจสอบยืนยันฤทธิ์ตาน มะเร็ ง ผลการศึ ก ษาพบว า สารสกั ด จากใบพลู แ สดง ฤทธิ์ยับยั้งการแพรกระจายของเซลลมะเร็งอยางมีนัย สำคั ญ ทางสถิ ติ ที่ ค วามเข ม ข น 30 และ 10 µg/mL สวนสารสกัดจากเหงาวานหอมแดงยับยัง้ การแพรกระจาย ของเซลล ม ะเร็ ง อย า งมี นั ย สำคั ญ ทางสถิ ติ เ ฉพาะที่ ความเขมขน 30 µg/mL โดยสารสกัดทั้งสองชนิดนี้ มีคา IC50 สำหรับฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเซลลมะเร็ง ต่ำกวา 100 µg/mL แสดงใหเห็นถึงฤทธิ์ตานมะเร็งใน เซลลเพาะเลี้ยง สอดคลองกับการศึกษาอื่นซึ่งพบวา สาร สกัดจากพืชทั้งสองชนิดนี้แสดงฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของ เซลลมะเร็งเพาะเลี้ยง(35-38) สำหรับสารสกัดจากเปลือก ตนมะยม แมจะไมแสดงฤทธิ์ยับยั้งการแพรกระจายของ เซลลมะเร็งทีค่ วามเขมขนทีท่ ดสอบ และมีคา IC50 สำหรับ ฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเซลลมะเร็งสูงกวา 100 µg/mL แตสารสกัดชนิดนี้มีคารอยละการยับยั้งการเจริญของ เซลลมะเร็งใกลเคียงกันในชวงความเขมขนทีท่ ดสอบ คือ 49.00±2.66% แสดงให เ ห็ น ว า สารสกั ด จากเปลื อ ก ตนมะยมแสดงฤทธิ์ตานมะเร็งไดระดับหนึ่ง โดยยับยั้ง การเจริญของเซลลในชวงความเขมขนที่กวาง ซึ่งยังไมมี รายงานการศึกษาฤทธิ์ตานมะเร็งในสารสกัดจากเปลือก ต น มะยม แต มี ร ายงานสารออกฤทธิ์ บ างชนิ ด ที่ ส กั ด แยกได จ ากรากและใบของต น มะยมแสดงฤทธิ์ ยั บ ยั้ ง การเจริญของเซลลมะเร็งเพาะเลี้ยง(39, 40) จึงจำเปนตอง ศึกษาเพิ่มเติม สำหรับสารสกัดจากกิ่งและใบทับทิมและ ตนน้ำนมราชสีห แมจะแสดงฤทธิ์ดีจากการทดสอบดวย ระบบทดสอบที่ พั ฒ นาขึ้ น แต เ มื่ อ ตรวจสอบยื น ยั น ฤทธิ์ตานมะเร็งในเซลลเพาะเลี้ยง พบวาไมแสดงฤทธิ์ ที่ความเขมขนที่ทดสอบ สาเหตุอาจเกิดจาก 1) การ ตรวจสอบยั ง ไม ค รอบคลุ ม เนื่ อ งจากไทโรซี น ไคเนส เกี่ ย วข อ งกั บ หลายกระบวนการ ทั้ ง การเจริ ญ เติ บ โต การแพรกระจาย การลุกลาม และการกระตุนการสราง หลอดเลื อ ดใหม ข องเซลล ม ะเร็ ง แต ก ารศึ ก ษานี้

การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งไทโรซีนไคเนส

ตรวจสอบเฉพาะฤทธิ์ ยั บ ยั้ ง การเจริ ญ และฤทธิ์ ยั บ ยั้ ง การแพร ก ระจายของเซลล ม ะเร็ ง เท า นั้ น จึ ง อาจต อ ง ตรวจสอบเพิ่ มเติม 2) สารแสดงฤทธิ์ที่ค วามเขม ขน สูงกวาที่ทดสอบ เชน สารสกัดจากน้ำนมราชสีห ซึ่งมี รายงานฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของเซลล HeLa ที่ความ เขมขนสูงกวา 100 µg/mL โดยมีคา IC50 ตอเซลลที่ เพาะเลี้ยงเปนเวลา 24, 48 และ 72 ชั่วโมง เปน > 200, 100.13±10.01 และ 144.60±5.52 µg/mL ตาม ลำดับ(41) และ 3) เกิดผลบวกปลอม สารสกัดสมุนไพร มีสารกลุม tannins เปนองคประกอบ ซึ่งสารกลุมนี้มี คุณสมบัติทำใหโปรตีนตกตะกอน(42) สารสกัดที่มีสัดสวน ของสารกลุม tannins สูง อาจทำใหไทโรซีนไคเนสเสีย สภาพ จนสงผลกระทบตอระบบทดสอบ ซึ่งทับทิมและ น้ำนมราชสีหตางมีสารกลุมนี้ (43,44) ซึ่งอาจเปนสาเหตุ หนึง่ ทีท่ ำใหคา รอยละการยับยัง้ การทำงานของไทโรซีนไคเนส สูงเกินจริงจนเกิดผลบวกปลอม ผลการศึ ก ษานี้ แ สดงให เ ห็ น ว า ระบบทดสอบที่ พัฒนาขึ้นสามารถใชคัดกรอง เพื่อคนหาสารตานมะเร็ง ที่มีกลไกยับยั้งการทำงานของไทโรซีนไคเนสได อยางไร ก็ตามอาจเพิ่มประสิทธิภาพของระบบทดสอบไดหาก ศึกษาปจจัยอื่นที่เกี่ยวของกับปฏิกิริยาไคเนสเพิ่มเติม เชน pH อุณหภูมิ ปริมาณ Mg2+ และ Mn2+ รวมถึงสวน ประกอบในสารละลายบัฟเฟอร และอาจนำไปปรับเปลีย่ น เพือ่ ประยุกตใชในการทดสอบฤทธิท์ จี่ ำเพาะตอไทโรซีนไคเนสชนิดใดชนิดหนึง่ ได โดยใชไทโรซีนไคเนสทีบ่ ริสทุ ธิ์ หรือใช cell lysate ของเซลลที่ถูกทำใหมีการแสดงออก ของโปรตีนทีส่ นใจเพิม่ สูงขึน้ จากการนำยีนของโปรตีนดัง กลาวเขาสูเ ซลล ซึง่ จำเปนตองทำการตรวจสอบและศึกษา สภาวะที่เหมาะสมเพิ่มเติม

สรุป การศึ ก ษานี้ ไ ด พั ฒ นาระบบทดสอบสำหรั บ วิเคราะหระดับการทำงานของเอนไซมไทโรซีนไคเนสดวย เทคนิค ELISA ซึ่งระบบทดสอบดังกลาวสามารถปฏิบัติ ไดในหองปฏิบัติการทั่วไป ครอบคลุมไทโรซีนไคเนส หลายชนิด และประหยัดตนทุน การทดสอบความใชได ของระบบ พบวาระบบทีพ่ ฒ ั นาขึน้ สามารถตรวจสอบฤทธิ์ ของสารตานมะเร็งที่มีกลไกยับยั้งไทโรซีนไคเนส มีความ

ภาณุพันธ ปญญาใจ และคณะ

คงทนตอตัวทำละลาย และสามารถทำซ้ำได เมื่อนำระบบ ทีพ่ ฒ ั นานีม้ าทดสอบกับตัวอยางสารสกัดสมุนไพรจำนวน มาก พบสารที่แสดงฤทธิ์จริง ระบบทดสอบนี้จึงอาจเปน ทางเลือกหนึง่ ในการใชสำหรับคัดกรองสารทีม่ ฤี ทธิย์ บั ยัง้ การทำงานของไทโรซีนไคเนสจากสารหลายชนิด เพื่อนำ ไปศึกษาและพัฒนาเปนยารักษามะเร็งตอไป

กิตติกรรมประกาศ การศึกษานี้ไดรับการสนับสนุนงบประมาณจาก กรมวิทยาศาสตรการแพทย และขอขอบคุณสถาบันวิจัย สมุ น ไพร กรมวิ ท ยาศาสตร ก ารแพทย ที่ ใ ห ค วาม อนุ เ คราะห ใ นการตรวจระบุ ช นิ ด พั น ธุ พื ช และจั ด ทำ ตัวอยางพรรณไมอางอิง

เอกสารอางอิง 1. Sung H, Ferlay J, Siegel RL, Laversanne M, Soerjomataram I, Jemal A, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin 2021; 71(3): 209-49. 2. กลุม ขอมูลขาวสารสุขภาพ. สถิตสิ าธารณสุข พ.ศ. 2562. นนทบุรี: กองยุทธศาสตรและแผนงาน สํานักงานปลัด กระทรวงสาธารณสุข; 2563. หนา 78-79. 3. Padma VV. An overview of targeted cancer therapy. BioMedicine. [serial online]. 2015; [cited 2021 Oct 21]; 5(4): [6 screens]. Available from: URL: https://biomedicine.cmu.edu.tw/ doc/17-1.pdf. 4. Gocek E, Moulas AN, Studzinski GP. Non-receptor protein tyrosine kinases signaling pathways in normal and cancer cells. Crit Rev Clin Lab Sci 2014; 51(3): 125-37. 5. Du Z, Lovly CM. Mechanisms of receptor tyrosine kinase activation in cancer. Mol Cancer. [serial online]. 2018; [cited 2021 Oct 21]; 17: [13 screens]. Available from: URL: https://doi. org/10.1186/s12943-018-0782-4. 6. Pottier C, Fresnais M, Gilon M, Jérusalem G, Longuespée R, Sounni NE. Tyrosine kinase inhibitors in cancer: breakthrough and วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

43

Development of Tyrosine Kinase Inhibitor Screening Assay

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

44

challenges of targeted therapy. Cancers. [serial online]. 2020; [cited 2021 Oct 21]; 12(3): [17 screens]. Available from: URL: https://doi. org/10.3390/cancers12030731. Metibemu DS, Akinloye OA, Akamo AJ, Ojo DA, Okeowo OT, Omotuyi IO. Exploring receptor tyrosine kinases-inhibitors in cancer treatments. Egypt J Med Hum Genet. [serial online]. 2019; [cited 2021 Oct 21]; 20(1): [16 screens]. Available from: URL: https://doi. org/10.1186/s43042-019-0035-0. Gopalakrishna R, Chen ZH, Gundimeda U, Wilson JC, Anderson WB. Rapid filtration assays for protein kinase C activity and phorbol ester binding using multiwell plates with fitted filtration discs. Anal Biochem 1992; 206(1): 24-35. Nakayama GR, Nova MP, Parandoosh Z. A scintillating microplate assay for the assessment of protein kinase activity. J Biomol Screen 1998; 3(1): 43-8. Park YW, Cummings RT, Wu L, Zheng S, Cameron PM, Woods A, et al. Homogeneous proximity tyrosine kinase assays: scintillation proximity assay versus homogeneous time-resolved fluorescence. Anal Biochem 1999; 269(1): 94-104. Kumar EA, Charvet CD, Lokesh GL, Natarajan A. High-throughput fluorescence polarization assay to identify inhibitors of Cbl(TKB)-protein tyrosine kinase interactions. Anal Biochem 2011; 411(2): 254-60. Rodems SM, Hamman BD, Lin C, Zhao J, Shah S, Heidary D, et al. A FRET-based assay platform for ultra-high density drug screening of protein kinases and phosphatases. Assay Drug Dev Technol 2002; 1(1): 9-19. Koresawa M, Okabe T. High-throughput screening with quantitation of ATP consumption: a universal non-radioisotope, homogeneous assay for protein kinase. Assay Drug Dev Technol 2004; 2(2): 153-60. King IC, Feng M, Catino JJ. High throughput assay for inhibitors of the epidermal growth วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Parnuphan Panyajai et al.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

factor receptor-associated tyrosine kinase. Life Sci 1993; 53(19): 1465-72. Baumann CA, Zeng L, Donatelli RR, Maroney AC. Development of a quantitative, high-throughput cell-based enzyme-linked immunosorbent assay for detection of colonystimulating factor-1 receptor tyrosine kinase inhibitors. J Biochem Bioph Methods 2004; 60(1): 69-79. Zhang XH, Guo XN, Zhong L, Luo XM, Jiang HL, Lin LP, et al. Establishment of the active catalytic domain of human PDGFRß tyrosine kinase-based ELISA assay for inhibitor screening. Biochim Biophys Acta 2007; 1770(10): 1490-7. Angeles TS, Steffler C, Bartlett BA, Hudkins RL, Stephens RM, Kaplan DR, et al. Enzymelinked immunosorbent assay for trkA tyrosine kinase activity. Anal Biochem 1996; 236(1): 49-55. Bauer SM, Gehringer M, Laufer SA. A direct enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantitative evaluation of Janus kinase 3 (JAK3) inhibitors. Anal Methods 2014; 6(21): 8817-22. Spandidos A, Wang X, Wang H, Seed B. PrimerBank: a resource of human and mouse PCR primer pairs for gene expression detection and quantification. Nucleic Acids Res. [serial online]. 2009; [cited 2021 Oct 21]; 38: [8 screens]. Available from URL: https://doi. org/10.1093/nar/gkp1005. Barber RD, Harmer DW, Coleman RA, Clark BJ. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics 2005; 21(3): 389-95. Ghosh G, Yan X, Kron SJ, Palecek SP. Activity assay of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in triple-negative breast cancer cells using peptide-conjugated magnetic beads. Assay Drug Dev Technol 2013; 11(1): 44-51. Iversen PW, Beck B, Chen YF, Dere W,

การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งไทโรซีนไคเนส

23.

24.

25. 26.

27.

28. 29. 30.

Devanarayan V, Eastwood BJ, et al. HTS assay validation. In: Assay guidance manual. [online]. 2012; [cited 2021 Oct 21]: [26 screens]. Available from: URL: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/books/NBK83783. Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen 1999; 4(2): 67-73. Riss TL, Moravec RA, Niles AL, Duellman S, Benink HA, Worzella TJ, et al. Cell viability assays. In: Assay guidance manual. [online]. 2012; [cited 2021 Oct 21]: [25 screens]. Available from: URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ books/NBK144065. Hulkower KI, Herber RL. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics 2011; 3(1): 107-24. Settasupana K, Pruksakorn P, Leunchaichaweng A, Prachasuphap A, Dhepakson P. Cloning, expression and purification of human CXCL12 alpha recombinant protein. Poster session presented at: The 24th Annual Medical Sciences Conference; Thailand. [online]. 2016 Jun 1-3; [cited 2021 Oct 21]: [1 screen]. Available from: URL: http://e-library.dmsc.moph.go.th/ ebooks/files/P2-11%20กัญจนรัชต.pdf. Dillenburg-Pilla P, Patel V, Mikelis CM, Zárate-Bladés CR, Doçi CL, Amornphimoltham P, et al. SDF-1/CXCL12 induces directional cell migration and spontaneous metastasis via a CXCR4/Gαi/mTORC1 axis. FASEB J 2015; 29(3): 1056-68. Hughes JP, Rees S, Kalindjian SB, Philpott KL. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol 2011; 162(6): 1239-49. Nicholson RI, Gee JMW, Harper ME. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer 2001; 37(Suppl 4): S9-15. Miyamoto M, Ojima H, Iwasaki M, Shimizu H, Kokubu A, Hiraoka N, et al. Prognostic significance of overexpression of c-Met oncoprotein in cholangiocarcinoma. Br J Cancer 2011; 105(1): 131-8.

ภาณุพันธ ปญญาใจ และคณะ 31. Chung CY, Yeh KT, Hsu NC, Chang JHM, Lin JT, Horng HC, et al. Expression of c-kit protooncogene in human hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 2005; 217(2): 231-6. 32. Nagaraj N, Wisniewski JR, Geiger T, Cox J, Kircher M, Kelso J, et al. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line. Mol Syst Biol. [serial online]. 2011; [cited 2021 Oct 21]; 7(1): [8 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.1038/msb.2011.81. 33. Herskovits TT, Gadegbeku B, Jaillet H. On the structural stability and solvent denaturation of proteins. I. Denaturation by the alcohols and glycols. J Biol Chem 1970; 245(10): 2588-98. 34. Tjernberg A, Markova N, Griffiths WJ, Hallén D. DMSO-related effects in protein characterization. J Biomol Screen 2006; 11(2): 131-7. 35. Lestari D, Kartika R, Marliana E. Antioxidant and anticancer activity of Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb on leukemia cells L1210. J Phys Conf Ser. [serial online]. 2019; [cited 2021 Oct 21]: 1277: [7 screens]. Available from: URL: https://iopscience.iop.org/ article/10.1088/1742-6596/1277/1/012022. 36. Suwarso E. The apoptosis effects of ethylacetate extract of Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb. against T47D cells. Int J PharmTech Res 2014-2015; 7(3): 535-9. 37. Widowati W, Wijaya L, Wargasetia T, Bachtiar I, Yelliantty Y, Laksmitawati D. Antioxidant, anticancer, and apoptosis-inducing effects of Piper extracts in Hela cells. J Exp Integr Med 2013; 3(3): 225-30. 38. Boontha S, Taowkaen J, Phakwan T, Worauaicha T, Kamonnate P, Buranrat B, et al. Evaluation of antioxidant and anticancer effects of Piper betle L (Piperaceae) leaf extract on MCF-7 cells, and preparation of transdermal patches of the extract. Trop J Pharma Res 2019; 18(6): 1265-72. 39. Duong TH, Bui XH, Pogam PL, Nguyen วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

45

Development of Tyrosine Kinase Inhibitor Screening Assay HH, Tran TT, Nguyen TAT, et al. Two novel diterpenes from the roots of Phyllanthus acidus (L.) Skeel. Tetrahedron 2017; 73(38): 5634-8. 40. Geng HC, Zhu HT, Yang WN, Wang D, Yang CR, Zhang YJ. New cytotoxic dichapetalins in the leaves of Phyllanthus acidus: Identification, quantitative analysis, and preliminary toxicity assessment. Bioorg Chem. [serial online]. 2021; [cited 2021 Oct 21]; 114: [6 screens]. Available from: URL: https://doi.org/10.1016/j. bioorg.2021.105125. 41. Kwan YP, Saito T, Ibrahim D, Al-Hassan FM, Ein Oon C, Chen Y, et al. Evaluation of the cytotoxicity, cell-cycle arrest, and apoptotic induction by Euphorbia hirta in MCF-7 breast cancer cells. Pharm Biol 2016; 54(7): 1223-36.

46

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Parnuphan Panyajai et al. 42. Silva GL, Kinghorn AD, Lee IS. Special problems with the extraction of plants. In: Cannell RJP, editors. Natural products isolation. New Jersey: Humana Press; 1998. p. 343-363. 43. Tanaka T, Nonaka GI, Nishioka I. Tannins and related compounds. XL. Revision of the structures of Punicalin and Punicalagin, and isolation and characterization of 2-O-galloylpunicalin from the bark of Punica granatum L. Chem Pharm Bull 1986; 34(2): 650-5. 44. Ahmad W, Singh S, Kumar S. Phytochemical screening and antimicrobial study of Euphorbia hirta extracts. J Med Plants Stud 2017; 5(2): 183-6.

การพัฒนาระบบทดสอบสำหรับคัดกรองสารยับยั้งไทโรซีนไคเนส

ภาณุพันธ ปญญาใจ และคณะ

Development of Tyrosine Kinase Inhibitor Screening Assay for Anti-cancer Agents Parnuphan Panyajai, Patamaporn Pruksakorn, Pantida Treeyoung, Chattraporn Jaima, and Panadda Dhepakson Medical Life Sciences Institute, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand

ABSTRACT Tyrosine kinases play a key role in various cellular signaling pathways, linking to prolife-

ration, migration, invasion and angiogenesis of cancer cells. Many of these are therapeutic targets for the treatment of cancers. This study aimed to develop the tyrosine kinase inhibitor assay for compound library screening. The assay development was started by investigating the expression levels of genes associated with these proteins in four cancer cell lines by quantitative real-time PCR, and measuring the tyrosine kinase activity of each cell lysate by ELISA. HeLa cell was chosen for the development. We further optimized the assay conditions, and the following were found: cell lysate, 0.125 mg/mL; peptide substrate, 0.25 µg/well; ATP, 25 nM; and incubation time of 30 minutes was suitable for the kinase reaction. The assay system was verified by using anti-cancer agents. The results showed that tyrosine kinase inhibitors decreased the assay signal. We also validated this assay by quantitative measurement of signal variability. It was shown that all parameters met the acceptance criteria, indicating that this assay was reproducible and suitable for screening. This developed assay was also used to test 180 medicinal plant extracts, and the active extracts were further tested by MTT and transmembrane assays. The results showed that some extracts exhibited potential anti-cancer activity in cell lines. Thus, the developed assay could be used for screening of tyrosine kinase inhibitors in a large number of samples. Keywords: Cancer, Tyrosine kinase inhibitor screening assay, Tyrosine kinase inhibitors, Cancer therapeutic targets

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

47

นิพนธตนฉบับ

ว กรมวิทย พ 2565; 64 (1): 48-66

การพัฒนาและทดสอบความใชไดของวิธวี เิ คราะห สารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล สำนักคุณภาพและความปลอดภัยอาหาร กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000

บทคัดยอ ฟโพรนิล (fipronil) เปนสารกําจัดแมลงที่เมื่อสลายตัวใหสารเมตาโบไลตที่มีพิษทําลายระบบประสาทรุนแรง

ประเทศไทยอนุญาตใหใชในพืชแตหามใชกับสัตวที่เปนอาหาร ในป พ.ศ. 2560 พบไขที่ผลิตในสหภาพยุโรปปนเปอน สารฟโพรนิล สรางความวิตกแกผูบริโภคไทย ทําใหตองหาวิธีเพื่อใชสําหรับตรวจสอบการตกคางของสารฟโพรนิลในไขและ ผลิตภัณฑที่จําหนายในประเทศไทย จึงไดพัฒนาการสกัดจากวิธี EN 15662: 2018 QuEChERS ตรวจวัดดวยเทคนิค selected reaction monitoring (SRM) จากเครือ่ ง GC-MS/MS คํานวณผลดวย matrix-matched calibration curve ผลการทดสอบความใชไดของวิธวี เิ คราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลต 2 ชนิด (fipronil-desulfinyl และ fipronil-sulfone) ในไขไกและไขเปด พบวาคา LOD และ LOQ เปน 0.002 และ 0.005 mg/kg ตามลําดับ การทดสอบความแมน กับตัวอยางทีเ่ ติมสารทีร่ ะดับ 0.005, 0.05 และ 0.1 mg/kg คารอยละในการคืนกลับ (recovery) อยูใ นชวง 92.9–111.6% โดยมี ความเทีย่ งแสดงดวย RSD นอยกวา 8.6% การประมาณคาความไมแนนอนของการวัดใหคา relative standard uncertainty นอยกวา 20% มีชวงการวิเคราะหอยูระหวาง 0.005–0.5 mg/kg อยูในเกณฑยอมรับ เปนวิธีที่มีความไว แมนยําและเชื่อถือได เหมาะสําหรับใชในหองปฏิบัติการ เมื่อใชวิธีนี้ตรวจสอบไขและผลิตภัณฑจํานวน 66 ตัวอยาง ที่เก็บจากกรุงเทพมหานครและ ปริมณฑลในป พ.ศ. 2564 ผลไมพบการตกคางของสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตในทุกตัวอยาง บงชี้วาวิธีที่พัฒนานี้สามารถนํา ไปใชสําหรับการเฝาระวังการตกคางในไขและผลิตภัณฑตอไป

คําสําคัญ: ฟโพรนิล, ไข, GC-MS/MS, การพัฒนาและทดสอบความใชไดของวิธี

Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 2 October 2021 Revised: 6 February 2022

48

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Accepted: 8 February 2022

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

บทนํา ฟโพรนิล (fipronil) เปนสารเคมีปองกันกำจัด ศัตรูพืช (pesticide) ประเภทสารฆาแมลง (insecticide) กลุม phenyl pyrazole มีขอบขายในการใชงาน กวาง สามารถกำจัดแมลงไดหลายชนิด เชน ใชกำจัดเห็บ และหมัดในสุนัข ใชฆาเพลี้ย หนอน มด ปลวก เปนตน(1) เปนสารที่ถูกจำกัดใหใชเฉพาะกับพืชและสัตวเลี้ยงใน บานเพือ่ การสาธารณสุขเทานัน้ หามมิใหใชในฟารมเลีย้ ง สัตวที่ใชเปนอาหาร เนื่องจากเมื่อสัตวไดรับสารฟโพรนิล เขาสูรางกายจะเกิดกระบวนการ metabolism เปนสาร เมตาโบไลต ที่ มี ค วามเป น พิ ษ ต อ มนุ ษ ย สู ง โดยเฉพาะ กับเด็ก(2) สำนักงานปกปองสิ่งแวดลอมแหงชาติของ สหรัฐอเมริกา (Environmental Protection Agency: EPA) พบวาเมื่อไดรับสารนี้เขาไปจะเกิดอาการเหงื่อ ออกมาก คลื่นไส อาเจียน ปวดและเวียนศีรษะ ปวดทอง ชั ก และเสี ย ชี วิ ต ได (3) ข อ มู ล จากองค ก ารอนามั ย โลก (World Health Organization: WHO) ระบุวาสาร ฟโพรนิลเปนสารพิษระดับกลาง จัดอยูใน Class II moderately hazardous เมือ่ ไดรบั ในปริมาณมากจะเปน อันตรายตอตับ ไต และระบบน้ำเหลือง(4) ฟโพรนิลเปนสาร ทีม่ โี มเลกุลขนาดเล็ก มีความเปนขัว้ ปานกลางและสามารถ ละลายในตัวทำละลายบางชนิดไดดี เชน acetone toluene เป น ต น (5) ในธรรมชาติ ส ารฟ โ พรนิ ล จะทำปฏิ กิ ริ ย า ตางๆ เชน photolysis, hydrolysis, reduction และ oxidation เกิดเปนสาร fipronil-desulfinyl, fipronil-amide, fipronil-sulfide และ fipronil-

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

sulfone ตามลำดับ(6) ดังแสดงในภาพที่ 1 การตรวจวัด การปนเป อ นตกค า งจึ ง ต อ งคำนึ ง ถึ ง สารเมตาโบไลต ตางๆ ที่เกิดขึ้นดวย เชน เมื่อสารฟโพรนิลถูก oxidized ดวย cytochrome P450 ในสัตวจะเกิดเปน fipronilsulfone(7) ซึ่งเปนสารที่มีความเปนพิษตอสัตวมีกระดูก สันหลังมากกวาเดิมถึง 20 เทา แมวาฟโพรนิลเปนสารที่ มีความคงตัวต่ำ แตสารเมตาโบไลตกลับมีความคงตัวสูงกวา มาก(8) นอกจากนี้ยังสามารถจับตัวกับชั้นไขมันไดดีมี คุณสมบัติเปน bioaccumulate ในหวงโซอาหาร พบวา ในธรรมชาติเมือ่ ฟโพรนิลถูกเรงปฏิกริ ยิ าดวยแสงเกิดเปน สาร fipronil-desulfinyl ในปริมาณมาก งานวิจัยนี้จึง เลือกตรวจวิเคราะหสารรวม 3 ชนิด ไดแก สารตัง้ ตนหรือ active form คือ ฟโพรนิล และสารเมตาโบไลต 2 ชนิด ไดแก fipronil-desulfinyl และ fipronil-sulfone จากการสืบคนวิธตี รวจวิเคราะหสารฟโพรนิล พบวา มีขอ มูลการพัฒนาและทดสอบความใชไดของวิธวี เิ คราะห ในปริ ม าณจำกั ด โดยปกติ จ ะใช เ ครื่ อ ง GC-ECD, GC-MS/MS และ LC-MS/MS เป น เครื่ อ งมื อ ตรวจวิเคราะห(9,10) สวนวิธีการเตรียมตัวอยางมีทั้งวิธี liquid-liquid partition, solid-phase extraction (SPE) และ solid-phase microextraction ซึ่งเปน วิธีที่ยุงยาก ใชสารเคมีจำนวนมาก และสงผลกระทบ ตอสิง่ แวดลอม ปจจุบนั มีการนำวิธี QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) มา ประยุกตใชอยางแพรหลาย(11) มีรายงานการใชวธิ นี สี้ ำหรับ การเตรียมตัวอยางไขเพือ่ วิเคราะหสารฟโพรนิลไมมากนัก

ภาพที่ 1 โครงสรางทางเคมีของสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตที่เกิดจากปฏิกิริยาตางๆ(5) วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

49

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

ซึ่งเปนวิธีที่นาจะมีความเหมาะสมตอการใชงานมากที่สุด เพราะนอกจากจะใช ต รวจวิ เ คราะห ฟ โ พรนิ ล แล ว ยั ง สามารถใชเปน multiresidue method รวมกับสาร ชนิ ด อื่ น ๆ ได เ ป น จำนวนมาก(12) มี ร ายงานการใช วิ ธี นี้สำหรับเตรียมตัวอยางไขเพื่อวิเคราะหสารฟโพรนิล ไมมากนัก รวมทั้งความทาทายของการเตรียมตัวอยางไข คือ การกำจัดสารรบกวน (interference) ที่เปนโปรตีน ไขมัน และคอเลสเตอรอล ซึ่งเปนองคประกอบใหไดมาก ทีส่ ดุ เพือ่ เพิม่ ความไว (sensitivity) ใหสามารถตรวจวัด ไดที่ระดับต่ำมากได การเลือกใช GC-MS/MS เปน เครื่องมือที่มีความเหมาะสมเพราะใหความไวและความ เปนเสนตรง (linearity) ของการวิเคราะหที่ดี ในป พ.ศ. 2560 องคการความปลอดภัยของ อาหารแหงสหภาพยุโรป (European Food Safety Authority: EFSA) พบการปนเปอนของสารฟโพรนิล และสารอื่นๆ ในตัวอยางไขไกท่ีมีการสุมตรวจ สูงเกิน กว า กฎหมายของสหภาพยุโ รปซึ่งกำหนดไวที่ 0.005 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม(13-15) ทำใหมีการทำลายไขไกเปน จำนวนมาก และมีการขยายผลการตรวจในสินคาเนื้อไก และผลิตภัณฑแปรรูปจากไขไกดวย สงผลใหเกิดความ ตระหนักไปทัว่ โลก ประเทศญีป่ นุ และ Codex(16) กำหนด ปริมาณสารพิษตกคางสูงสุด (Maximum Residue Limit: MRL) ของสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตใน ไขที่ 0.02 มิลลิกรัมตอกิโลกรัม สำหรับประเทศไทย กำหนดตามประกาศกระทรวงสาธารณสุข เลขที่ 387 พ.ศ. 2560 เรื่อง อาหารที่มีสารพิษตกคาง โดยกำหนด ปริ ม าณสารพิ ษ ตกค า งสู ง สุ ด ในพื ช บางชนิ ด ที่ ร ะดั บ แตกตางกันไป และคาดีฟอลตลิมิต (default limit) สำหรับอาหารอื่นๆ รวมทั้งไขไวที่ 0.005 มิลลิกรัมตอ กิโลกรัม โดยชนิดสารพิษตกคางในพืชเปน fipronil (ละลายในไขมัน) และในสัตวเปนผลรวมของ fipronil และ fipronil-sulfone รายงานผลเป น fipronil (ละลายในไขมั น ) (17) ซึ่ ง ป จ จุ บั น กรมวิ ท ยาศาสตร การแพทย โดยสำนั ก คุ ณ ภาพและความปลอดภั ย อาหาร ใหบริการตรวจวิเคราะหสารฟโพรนิลในผักและ ผลไม(18) โดยมี limit of detection (LOD) เทากับ 0.01 มิ ล ลิ ก รั ม ต อ กิ โ ลกรั ม แต ยั ง ไม มี วิ ธี ต รวจสาร ฟโพรนิลและเมตาโบไลตในไขและผลิตภัณฑในระดับ

50

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

ที่กฎหมายกำหนด จึงตองมีการพัฒนาวิธีเตรียมตัวอยาง การสกัดและการตรวจวัดดวยเครื่องมือ ใหสามารถตรวจ วิเคราะหไดตามคาที่กฎหมายกำหนด นอกจากนี้ตอง มีการประเมินความใชไดของวิธี เพื่อใชในงานบริการ เมื่ อ ได วิ ธี วิ เ คราะห ที่ เ หมาะสมแล ว จึ ง ทำการสุ ม เก็ บ ตั ว อย า งเพื่ อ สำรวจติ ด ตามเบื้ อ งต น การปนเป อ นของ สารฟโพรนิล ปจจุบันไมพบขอมูลการใชสารฟโพรนิล ในฟารมไกในประเทศไทย และยังไมมรี ายงานการสำรวจ การปนเป อ นของสารฟ โ พรนิ ล ในไข ไ ก ใ นประเทศ จึงเปนการสำรวจครั้งแรกของประเทศไทยวามีการใช งานผิดวัตถุประสงคหรือไม เพื่อทราบสถานการณและ สามารถใชเพื่อแจงเตือนภัย โดยทำการสุมเก็บตัวอยาง จากตลาดสด หางสรรพสินคา รานคาปลีก และราน สะดวกซื้อในพื้นที่ประชากรหนาแนนของประเทศ คือ เขตกรุงเทพมหานครและปริมณฑล 5 จังหวัด ไดแก ปทุมธานี นครปฐม นนทบุรี สมุทรปราการ และสมุทรสาคร รวมทัง้ สิน้ 6 จังหวัด ซึง่ สินคาทีผ่ ลิตในเขตเกษตรกรรมอืน่ ถู ก นำมาจำหน า ยในบริ เ วณนี้ จ ำนวนมาก และมี ก าร กระจายตัวของสินคาออกไปในบริเวณกวาง หากพบ การปนเป อ นจะสามารถตรวจสอบกลั บ ไปยั ง แหล ง ผลิตได แตหากไมพบการปนเปอนใดๆ ในบริเวณนี้ อาจมีการขยายผลเปนโครงการสำรวจติดตามไปยังพื้นที่ ตางๆ ใหครอบคลุมทั้งประเทศตอไป งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงคเพื่อพัฒนาและทดสอบ ความใชไดของวิธีวิเคราะหสารฟโพรนิลตกคางในไขและ ผลิตภัณฑ สำหรับใหบริการตรวจวิเคราะหตามประกาศ กระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 387 พ.ศ. 2560 เรือ่ ง อาหาร ที่มีสารพิษตกคาง และคากำหนดของโครงการมาตรฐาน อาหารระหว า งประเทศ (Codex Alimentarius) โดยมี คุ ณ ลั ก ษณะของวิ ธี ส อดคล อ งกั บ มาตรฐานและ กฎหมายที่เกี่ยวของ รวมทั้งสำรวจและตรวจสอบสินคา ไขและผลิตภัณฑจากไขทจี่ ำหนายในเขตกรุงเทพมหานคร และปริมณฑล เพื่อใหทราบสถานการณเบื้องตนของ การตกคางของสารฟโพรนิลในอาหารกอนถึงมือผูบ ริโภค ใช ผ ลสำหรั บ แจ ง เตื อ นภั ย และขยายผลการสำรวจ ติดตามในวงกวางใหครอบคลุมทั้งประเทศตอไป อีกทั้ง สามารถนำเสนอขอมูลใหแกหนวยงานทีเ่ กีย่ วของสำหรับ การจัดการความเสี่ยงของการไดรับสารพิษอีกดวย

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

วัสดุและวิธีการ สารเคมีและสารมาตรฐาน สารเคมี (Reagents) ได แ ก acetonitrile (HPLC, Merck, USA) acetone (AR, RCl Labscan, USA) n-hexane (PG, Burdick & Jackson, USA) ethyl acetate (HPLC, Burdick & Jackson Korea) QuEChERS Extraction Packet (Agilent Technologies, USA) EN Method Part No: 5982-7650 เป น ส ว นผสมของ MgSO 4 4 g NaCl 1 g sodium citrate dehydrate 1 g และ disodium hydrogen citrate sesquihydrate 0.5 g Dispersive SPE 15 mL, Fatty sample, EN (Agilent Technologies, USA) เปนสวนผสมของ MgSO4 900 mg PSA 150 mg และ C18EC 150 mg (Agilent Technologies,USA) น้ำ rverse osmosis (RO) D-sorbitol (AR, purity ≥ 98%) วัสดุควบคุม คุณภาพ Quality Control Material (QCM) FCPM11EGG2QC Pesticide Residues (fat soluble) in Chicken (Hens) สารมาตรฐาน (standards) ไดแก fipronil fipronil-desulfinyl และ fipronil-sulfone เกรด วัสดุอางอิงรับรอง (Certified Reference Material: CRM, Dr. Ehrenstorfer, Germany) ความบริสุทธิ์ (purity) ≥ 98.5% การเตรียมสารละลายมาตรฐาน ทำโดยเตรียมสารละลาย มาตรฐาน (Stock standard solution) แตละชนิด ที่มีความเขมขน 100 μg/mL ใน acetone แลวเตรียม สารละลายมาตรฐานผสม 3 ชนิด (mixed intermediate standard solution) ความเขมขน 10 μg/mL ใน volumetric flask ขนาด 10 mL ปรับปริมาตรดวย acetone เก็บรักษาที่อุณหภูมิ ≤ -18°C กอนการใชงาน เจือจาง intermediate standard solution ดวย acetone หรือสารสกัดจากตัวอยาง เพื่อทำ working standard solution ชวงความเขมขน 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 และ 1.0 μg/mL เติมสารละลาย D-sorbitol 3% (analytical protectant) ปริมาตร 3 μL ในสารละลาย 1 mL ใชวิเคราะห

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

ทันทีหรือสามารถเก็บรักษาทีอ่ ณ ุ หภูมิ ≤ -18°C ไดไมเกิน 1 สัปดาห เครื่องมือและอุปกรณ เครื่องชั่งความละเอียด 0.001 g Sartorius รุน LP 620S และ 0.01 mg Sartorius รุน MC 210S (Sartorius AG, Germany) สำหรับชั่งตัวอยางและ สารมาตรฐานเครื่องระเหยสารละลายแบบ heating box และใชแกสไนโตรเจน (N 2) ในการระเหยสาร สกัด REACTI-THERM III #TS-18824 Thermo scientific เครื่องหมุนปนผสมสารละลาย Vortex-2 Genie micropipette ขนาด 2–20 μL amber vial centrifuge tube ตูแชแข็งอุณหภูมิต่ำกวา -18°C certified volumetric flask กอนการใชงานเครื่องแกว ทุกชนิดใหลา งดวย acetone 2 ครัง้ และ n-hexane 2 ครัง้ จากนั้นผึ่งใหแหงกอนนำมาใชงาน เครื่ อ ง Gas Chromatograph-Tandem Mass Spectrometry (GC-MS/MS) ของ Thermo Scientific TRACE™ 1300 Gas Chromatograph (Thermo Scientific, Italy) ตอกับเครื่อง TSQ 9000, Triple Quadrupole Mass Spectrometer (Thermo Scientific, Italy) โดยใช PAL RTC autosampler และใช TraceFinder 4.1 EFS software ทำใหสารเปนประจุดวย electron ionization mode (EI, 70 eV) สารจะถูกแยกดวย fused silica capillary column DB-5ms (30 m x 0.25 mm i.d., 0.25 µm film thickness) ของ Agilent Technologies โปรแกรม ทีใ่ ชสำหรับปรับอุณหภูมใิ น oven ของเครือ่ ง GC เริม่ จาก 70°C เปนเวลา 1 นาที เพิ่มที่อัตรา 50°C ตอนาที จนถึง 150°C เพิ่มที่อัตรา 6°C ตอนาที จนถึง 200°C เพิ่มที่ อัตรา 16°C ตอนาที จนถึง 280°C คงไว 8.5 นาที จากนัน้ เพิ่มที่อัตรา 50°C ตอนาที ถึงอุณหภูมิสุดทายที่ 300°C คงไว 0.5 นาที ใชเวลาทั้งสิ้นประมาณ 25 นาที โดยมี injection volume เปน 2 μL ใช inlet ชนิด programmable temperature vaporizing (PTV) ตั้งอุณหภูมิของ PTV ไวที่ 80°C คางไว 0.1 นาที เพิ่มที่อัตรา 5°C ตอวินาที จนถึง 300°C ตั้งอุณหภูมิ วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

51

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

ion source เปน 280°C และ quadrupole MS1 และ MS2 เปน 180°C เมื่อสารเขาสูเครื่อง GC-MS/ MS จะถูกทำใหแตกตัวเปนประจุโดยใชแกสไนโตรเจน

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

เปน quench gas และ Argon เปน collision gas ถูกตรวจวัดดวย selected reaction monitoring (SRM) mode ดังแสดงในตารางที่ 1 และภาพที่ 2

ตารางที่ 1 Selected reaction monitoring (SRM) transitions และ collision energies ของสาร fipronil และเมตาโบไลต Compound (RT, min) fipronil-desulfinyl (12.07)

fipronil (13.86)

fipronil-sulfone (15.02)

52

Precursor (m/z) 333 333 388 388 390 390 255 255 351 367 367 369 255 335 383 385 452 452

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Product (m/z) 231 281 281 333 333 335 157 228 255 213 245 215 228 255 255 257 241 255

Collision Energy (eV) 20 12 26 12 12 12 34 14 14 28 20 30 10 10 15 15 20 25

Transition type Quantification Qualification-1 Qualification-2 Qualification-3 Qualification-4 Qualification-5 Quantification Qualification-1 Qualification-2 Qualification-3 Qualification-4 Qualification-5 Quantification Qualification-1 Qualification-2 Qualification-3 Qualification-4 Qualification-5

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

ภาพที่ 2 กลไกการทำงานของ selected reaction monitoring (SRM) mode ดวยเครื่อง GC-MS/MS (ภาพจากเอกสารประกอบการบรรยายการใชเครื่องมือจากบริษัท AB Sciex Thailand Ltd.) ตัวอยางและการเตรียมตัวอยาง ตัวอยางที่ใชในการพัฒนาและทดสอบความใชได ของวิธี 2 ชนิด ไดแก ไขไกและไขเปด ใชเฉพาะไขขาวและ ไขแดง ไมรวมเปลือก ปนผสมตัวอยางแตละชนิดใหเปน เนื้อเดียวกันดวยเครื่องตีผสมอาหาร ชั่งแบงตัวอยางเพื่อ เปน analytical portions โดยชั่งตัวอยางน้ำหนักไขไก และไขเปด 10.0±0.1 g ลงใน centrifuge tube ขนาด 50 mL ตัวอยางที่ยังไมนำมาวิเคราะหจะถูกเก็บรักษา ในตูแชแข็งที่อุณหภูมิต่ำกวา -15°C สำหรับตัวอยาง ที่ เ ป น ผลิ ต ภั ณ ฑ จ ากไข ใช ตั ว อย า งอาหารประมาณ 200–300 กรัม ปนผสมใหเปนเนื้อเดียวกัน การสกัดตัวอยาง นำตัวอยางทีช่ งั่ ไวเติม acetonitrile ปริมาตร 10 mL เขยาดวยมืออยางแรง 1 นาที เติม QuEChERS extraction pocket เขยาตออีก 1 นาที นำไปปนตกตะกอนดวยความเร็ว 4,000 รอบตอนาที นาน 5 นาที แบ ง สารสกั ด ส ว นใสด า นบน 5 mL ใสใน centrifuge tube ขนาด 15 mL จากนั้นเติม Dispersive SPE เขยาดวยมือ 30 วินาที นำไปปนตก ตะกอนดวยความเร็ว 4,000 รอบตอนาที นาน 5 นาที เก็บสารละลายชั้นบน ปริมาตร 2 mL นำไประเหยแหง ปรับปริมาตรดวยตัวทำละลายผสมของ n-hexane:ethyl acetate (3:1) เปน 2 mL เติม D-sorbitol 3% ปริมาตร 6 μL ไดความเขมขนตัวอยาง 1 g/mL จากนัน้ นำไปวิเคราะห ดวยเครื่อง GC-MS/MS ตัวอยางสำหรับการสำรวจติดตามเบื้องตน สำนัก คุณภาพและความปลอดภัยอาหาร ทำการเก็บตัวอยาง ได แ ก ไข ส ดชนิ ด แบ ง ขายและชนิ ด มี บ รรจุ ภั ณ ฑ

ประกอบด ว ยไข ไ ก แ ละไข เ ป ด ตั ว อย า งละ 12 ฟอง ไขนกกระทา ตัวอยางละ 30 ฟอง และผลิตภัณฑจากไข ได แ ก ขนมที่ ท ำจากไข เช น ทองหยอด ทองหยิ บ ฝอยทอง ตัวอยางละ 200–300 g ไขเหลวบรรจุขวดไขตนุ พรอมบริโภคเตาหูไข ตัวอยางละ 2 หนวย (ขวด/ถวย /หลอด) และไขผง ตัวอยางละ 200–300 g โดยสถานที่ เก็บตัวอยางเปนตลาดสด หางสรรพสินคารานคาปลีก และ รานสะดวกซือ้ ในเขตกรุงเทพมหานคร ปทุมธานี นครปฐม นนทบุรี สมุทรปราการ และสมุทรสาคร รวม 6 จังหวัด จำนวน 11 ตัวอยางตอจังหวัด รวมทั้งสิ้น 66 ตัวอยาง โดยแบงระยะการเก็บเปน 3 เดือน เดือนละ 2 จังหวัด ดังแสดงในตารางที่ 2 ตารางที่ 2 แผนการเก็บตัวอยางไขและผลิตภัณฑ จำนวน 66 ตัวอยาง ในป พ.ศ. 2564 (จังหวัดละ 11 ตัวอยาง) เดือน เมษายน พฤษภาคม มิถุนายน

จังหวัด กรุงเทพมหานคร นนทบุรี ปทุมธานี สมุทรสาคร นครปฐม สมุทรปราการ

การพัฒนาและทดสอบความใชไดของวิธีวิเคราะห การพัฒนาวิธีวิเคราะห ประยุกตใชวธิ ที อี่ า งอิงจากวิธมี าตรฐานของสหภาพ ยุโรป EN 15662:2018 ซึ่งเปนวิธีวิเคราะหสารเคมี ปองกันกำจัดศัตรูพืชในอาหารที่เปนผลิตภัณฑจากพืช (food of plant origin) แบบ multiresidue method วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

53

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

ดวยเครื่องแกสโครมาโทกราฟ (GC) และเครื่องลิควิด โครมาโทกราฟ (LC) โดยการสกัดดวย acetonitrile และ partition ดวยวิธี QuEChERS ทำใหบริสุทธิ์ดวย dispersive SPE ดั ด แปลงให ใ ช กั บ อาหารที่ เ ป น ผลิตภัณฑจากสัตว (animal origin food) ซึ่งเปน ตัวอยางไขไกและไขเปด ดวยการหา mass transition condition จากเครื่อง GC-MS/MS ที่จำเพาะตอสาร สนใจและคัดเลือก dispersive SPE ที่เหมาะสมตอ การวิเคราะหอาหารที่มีไขมันเปนองคประกอบ (fatty sample) รวมถึงการปรับตัวทำละลายสุดทายใหมีความ เปนขั้วที่เหมาะสมกับสารฟโพรนิล ความจำเพาะของวิธี ฉีดสารมาตรฐานเขาเครื่อง GC-MS/MS ตาม สภาวะที่กำหนด จำนวน 3 ซ้ำ บันทึก retention time (RT) และ ion intensity ratio แลวทดสอบความ จำเพาะของวิธีโดยวิเคราะห method blank (reagent blank) ที่ใชน้ำ RO แทนตัวอยาง และ sample blank ไดแก ไขไกและไขเปด เมื่อไมพบพีคหรือพบพีคที่มี สัญญาณ signal-to-noise ratio (S/N) นอยกวา 3 ที่มี RT และ/หรือ คา m/z ใกลเคียงกับสารมาตรฐาน ถือวาวิธีปราศจากสารรบกวนและวิธีมีความจำเพาะ ความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐาน กราฟมาตรฐานแบบ matrix-matched calibration (MMC) ศึกษาโดยใชสารสกัดทีไ่ ดจากไขไก และไข เ ป ด ที่ เ ป น blank เป น ตั ว ทำละลาย เจื อ จาง intermediate standard solution ใหได 12 ระดับ ความเขมขน ไดแก 0.0002, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 และ 1 μL/mL และฉีดเขาเครื่อง GC-MS/MS แบบสุม (random, n = 3) คำนวณหาคาสัมประสิทธิส์ หสัมพันธ (correlation coefficient: r) กำหนดเกณฑยอมรับ r มีคามากกวา 0.995 ขีดจำกัดของการตรวจพบ ขีดจำกัดของการตรวจพบ (limit of detection: LOD) ศึกษาโดยเติมสารละลายมาตรฐานลงในสารสกัด จากไขไกและไขเปดทีร่ ะดับ LOD แลวนำไปฉีดเขาเครือ่ ง GC-MS/MS คำนวณคา signal-to-noise ratio

54

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

(S/N) จากนั้นยืนยันคา LOD ที่ระดับความเขมขน 0.002 mg/kg โดยเติมสารมาตรฐานลงในตัวอยางไขไก และไขเปด สกัดตามขัน้ ตอนวิเคราะหจำนวน 7 ซ้ำ (n = 7) แลวคำนวณคา S/N คา LOD คือ ระดับความเขมขนที่ ใหคา S/N มากกวา 3 ขีดจำกัดของการวัดเชิงปริมาณ ขีดจำกัดของการวัดเชิงปริมาณ (limit of quantitation: LOQ) ศึกษาโดยใชขอมูลจากการทดสอบ ความแมนและความเที่ยงของการวิเคราะห ที่ระดับความ เขมขน 0.005 mg/kg วิเคราะห จำนวน 7 ซ้ำ (n = 7) แลวคำนวณ %recovery กำหนดเกณฑยอมรับอยูใน ชวงรอยละ 70–120 และคาเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ (RSD) กำหนดเกณฑยอมรับ ≤ 20% ความเปนเสนตรงของชวงการวิเคราะห ความเปนเสนตรงของชวงการวิเคราะหศึกษาโดย การเติมสารมาตรฐานในตัวอยาง (sample blank) ที่ 6 ระดับความเขมขน ไดแก 0.005, 0.020, 0.050, 0.1, 0.2 และ 0.5 mg/kg วิเคราะหระดับละ 3 ซ้ำ (n = 3) สรางกราฟความสัมพันธระหวางความเขมขนที่เติมลง ในตั ว อย า งกั บ ความเข ม ข น ที่ ต รวจพบ คำนวณหา คาสัมประสิทธิส์ หสัมพันธ (correlation coefficient: r) กำหนดเกณฑยอมรับ r มีคามากกวา 0.995 ความแม น (accuracy) และความเที่ ย ง (precision) ศึกษาโดยเติมสารมาตรฐานในตัวอยาง (sample blank) ที่ 3 ระดับความเขมขน ไดแก LOQ, 10 และ 20 เทาของ LOQ ซึง่ มีความเขมขนเปน 0.005, 0.05 และ 0.1 mg/kg ตามลำดับ วิเคราะหระดับละ 7 ซ้ำ (n = 7) แลวคำนวณ %recovery และ RSD โดยเกณฑยอมรับ ความแมน (mean recovery) ในชวง 70–120% และ เกณฑยอมรับความเที่ยง (RSD) มีคา ≤ 20% การประมาณคาความไมแนนอนของการวัด การประมาณค า ความไม แ น น อนของการวั ด (Estimation of Measurement Uncertainty: MU) ของการวิเคราะหสารกำจัดศัตรูพืชในอาหารที่ทดสอบ ใชวิธีการของ EURACHEM(19) ซึ่งเปนการคำนวณ โดยใช ทุ ก แหล ง ที่ ม าของความไม แ น น อน จากนั้ น

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

คำนวณค า ความไม แ น น อนขยายที่ ร ะดั บ ความเชื่ อ มั่ น รอยละ 95 โดยใชคา k = 2 เปนวิธีที่มีความถูกตองเปน ที่ยอมรับและเหมาะสมตอการนำไปใชงาน การทดสอบผลกระทบของเมทริกซ ศึกษาผลกระทบของเมทริกซ (matrix effect: ME) โดยฉี ด สารมาตรฐานความเข ม ข น ที่ ต อ งการที่ ไ ด จ าก spiked matrix blank และ standard on solution แลวสราง curve ระหวางความเขมขน (x-axis) กับ peak area หรือ intensity/response (y-axis) คำนวณ slope ของกราฟมาตรฐาน จากสมการ y = ax+b โดย x คือ analyte concentration, y คือ analyte peak, a คือ ความชันของ calibration curve และ b คือ จุด ตัดแกน y คำนวณ matrix factor จากสมการ MF (matrix factor) = a(matrix)/a(solvent) จากนั้น คำนวณ ME (%) จากสมการ ME (%) = (MF-1) × 100 หากผลการประเมินพบวา ME (%) มีผลกระทบนอย (soft) แสดงวาผลกระทบของเมทริกซไมมีผลอยางมีนัย สำคัญทางสถิตขิ องการวิเคราะห และสามารถใช standard on solution ในการคำนวณผลได หากพบวามีผลกระทบ ปานกลางและมาก (medium and strong) แสดงวา ไมสามารถใช standard on solution ในการคำนวณ

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

ผลได เกณฑการตัดสินผลกระทบของเมทริกซ ดังแสดง ในตารางที่ 3 หากเครื่องหมาย ME (%) เปนบวก ผลกระทบของเมทริกซจะเปนแบบ enhancement หาก เครื่องหมาย ME (%) เปนลบ ผลกระทบของเมทริกซ จะเปนแบบ suppression(20) การทวนสอบความใชไดของวิธี การทวนสอบความใชไดของวิธีศึกษาโดยนำวัสดุ ควบคุมคุณภาพในตัวกลาง (matrix quality control material) QCM Product Code FCPM11-EGG2QC จาก FAPAS® ซึ่งทราบคาความเขมขนของ fipronilsulfone ใน chicken (hens) eggs เปน 12.0 μg/kg มีชวงยอมรับอยูระหวาง 6.7–17.3 μg/kg เมื่อวิเคราะห ดวยวิธีที่พัฒนาขึ้นแลว ผลที่ไดตองอยูในชวงยอมรับ จึงจะแสดงวาวิธีมีความถูกตอง และขยายขอบขายชนิด ตัวอยางจากการใชตัวอยางไขไกและไขเปดในขั้นตอน การทดสอบความใชไดของวิธี ดวยการทำ internal quality control โดยการทดสอบการคืนกลับที่ระดับ LOQ ในตัวอยางไขนกกระทาและผลิตภัณฑอาหารที่ทำ จากไขอื่นๆ ทุกชนิดที่ทำการทดสอบ ผลตองอยูในเกณฑ ยอมรับ %recovery อยูระหวาง 70–120%

ตารางที่ 3 เกณฑการตัดสินผลกระทบของเมทริกซ Matrix effect (%) -20% to 20 % > 20% to 50% > 50%

Consideration Soft Medium Strong

Result Negative (-) Zero (0) Positive (+)

Consideration Suppression No matrix effect Enhancement

ผล ผลการทดสอบความใชไดของวิธีวิเคราะห ความ จำเพาะของวิ ธี พบว า peak ที่ ไ ด จ ากการวิ เ คราะห method blank และ sample blank ที่เปนไขไกและ ไขเปด โดยใชเครื่อง GC-MS/MS ดวยเทคนิค SRM ตรวจไม พ บสารรบกวนที่ ใ ห พี ค ตรงหรื อ ใกล เ คี ย งกั บ retention time (RT) ของสารมาตรฐาน และพีคที่

ตรวจพบมีสัญญาณ signal-to-noise ratio (S/N) นอยกวา 3 ซึ่งแสดงวาวิธีมีความจำเพาะ ดังแสดงในภาพ ที่ 3 การวิเคราะหแบบ SRM ดวยเครื่อง GC-MS/MS ทำใหตรวจวัดพีคสารฟโพรนิลและเมตาโบไลต ไดอยาง ชั ด เจน เป น เทคนิ ค ที่ มี ค วามไวและความจำเพาะสู ง สามารถตรวจวัดสารสนใจในเมทริกซที่มีสารรบกวนไดดี ดังแสดงในภาพที่ 4-5 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

55

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

ภาพที่ 3 โครมาโทแกรมของ method blank (a) matrix blank ไขไก (b) และ matrix blank ไขเปด (c)

ภาพที่ 4 Quantification and qualification peak ของสาร fipronil-desulfinyl (a), fipronil (b) และ fipronil-sulfone (c)

56

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

ภาพที่ 5 Total ion chromatogram (TIC) ของสาร fipronil-desulfinyl, fipronil และ fipronil-sulfone ใน acetone (a), ไขไก (b) และไขเปด (c) ความเปนเสนตรงของกราฟมาตรฐานสามารถ สรางกราฟมาตรฐานความสัมพันธระหวาง concentration กับ peak area (response) ของสารสนใจมีความ เปนเสนตรงในชวง 0.0002 ถึง 1 µL/mL ดังแสดงใน ภาพที่ 6 โดยกราฟมาตรฐานของสารทุกชนิดมีคา r ในชวง 0.997–0.999 ซึ่งสูงกวาเกณฑยอมรับที่ 0.995 ผลการทดสอบขีดจำกัดของการตรวจพบ (LOD) ของสารทั้ง 3 ชนิด เทากับ 0.002 mg/kg (S/N > 3) และการยืนยันโดยการสกัดตัวอยางที่ระดับ LOD ผลพบ วาพบสารทุกชนิดทั้ง 7 ซ้ำ โดยมีขีดจำกัดของการวัดเชิง ปริมาณ (LOQ) มีคาเทากับ 0.005 mg/kg ดังแสดง ในตารางที่ 4 ผลการทดสอบความแมนและความเที่ยงของวิธี ดังแสดงในตารางที่ 5 ความแมนและความเที่ยงที่ระดับ

LOQ, 10 และ 20 เทาของ LOQ ที่ 0.005, 0.05 และ 0.1 mg/kg ให %recovery อยูระหวาง 92.9–111.6% โดยมีความเที่ยงแสดงดวย RSD นอยกวา 8.6% ซึ่งอยู ในเกณฑยอมรับที่ 70–120% และ ≤ 20% ตามลำดับ ผลการทดสอบความเป น เส น ตรงของช ว งการ วิเคราะหดังแสดงในตารางที่ 4 LOD ที่ 0.002 mg/kg และ LOQ ที่ 0.005 mg/kg พบวาสารทั้ง 3 ชนิด มีชวง ความเปนเสนตรงอยูระหวาง 0.005–0.5 mg/kg ดวย คุณลักษณะทั้งหมดที่ทำการทดสอบความใชไดแสดงวา สามารถใชวิธีนี้วิเคราะหสารสนใจดังกลาวได การทดสอบผลกระทบของเมทริกซ จากภาพที่ 6 ความชันของกราฟมาตรฐานสาร fipronil-desulfinyl, fipronil และ fipronil-sulfone และคา ME (%) ทีค่ ำนวณ ไดดังแสดงในตารางที่ 6 พบวาผลกระทบของเมทริกซ วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

57

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

ตารางที่ 4 ผลการทดสอบ Limit of detection (LOD), Limit of quantitation (LOQ) และ Linearity of working range Compounds fipronil-desulfinyl fipronil fipronil-sulfone

S/N ratio (at LOD = 0.002 mg/kg) Infinity 31-4329 63-170

Working range r (mg/kg) (chicken egg/duck egg) 0.005-0.5 0.9998/0.9990 0.005-0.5 0.9997/0.9991 0.005-0.5 0.9998/0.9995

ตารางที่ 5 ผลการทดสอบความแมนและความเที่ยง (accuracy and precision) Compounds

Matrix chicken egg

fipronil-desulfinyl duck egg chicken egg fipronil duck egg chicken egg fipronil-sulfone duck egg

58

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Spiked level (mg/kg) 0.005 0.05 0.1 0.005 0.05 0.1 0.005 0.05 0.1 0.005 0.05 0.1 0.005 0.05 0.1 0.005 0.05 0.1

%Recovery (mean, mg/kg) 95.7 (0.00479) 99.1 (0.04956) 99.1 (0.09908) 98.8 (0.00494) 94.4 (0.04720) 111.0 (0.11100) 92.9 (0.00465) 100.7 (0.05033) 101.0 (0.10100) 111.6 (0.00558) 100.7 (0.05034) 104.2 (0.10420) 96.2 (0.00481) 105.1 (0.05256) 101.6 (0.10160) 107.0 (0.00535) 99.1 (0.04954) 110.8 (0.11080)

%RSD 8.62 6.11 4.86 6.17 5.55 7.86 6.47 6.40 5.77 6.55 8.57 8.56 5.64 5.41 2.85 6.03 6.22 8.15

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

ภาพที่ 6 กราฟมาตรฐานของสาร fipronil-desulfinyl (a), fipronil (b) และ fipronil-sulfone (c) ใน solution, matrix ไขไก และ matrix ไขเปด ตารางที่ 6 ผลกระทบของ matrix ของ fipronil-desulfinyl, fipronil และ fipronil-sulfone แบบ on solution, matrix ไขไก และ matrix ไขเปด Compound fipronil-desulfinyl fipronil fipronil-sulfone

Matrix Effect (%) chicken/solution duck/solution 39.67 medium 54.47 strong 60.60 strong 92.07 strong 53.75 strong 78.74 strong

chicken/duck 9.58 soft 6.39 soft 13.98 soft

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

59

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

ไขไกและไขเปดตอการวิเคราะห on solution เปนแบบ เพิ่มสัญญาณ (enhancement) และไขทั้ง 2 ชนิด ไมมี ผลกระทบอยางมีนัยสำคัญทางสถิติของการวิเคราะห ตอกัน สามารถใชทดแทนกันไดและพบวาผลกระทบ ของเมทริ ก ซ ไ ข ไ ก แ ละไข เ ป ด มี ผ ลอย า งมี นั ย สำคั ญ ทางสถิติของการวิเคราะหตอการวิเคราะห on solution ดังแสดงในภาพที่ 7

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

ผลการประมาณคาความไมแนนอนของการวัดตาม แนวของ ISO GUM Approach หรือ Bottom-up approach (ที่ระดับความเชื่อมั่นประมาณ 95%, k = 2) จากการประมาณคาความไมแนนอน พบวาแหลงความ ไมแนนอนที่สำคัญที่สุด คือ calibration curve (C0) (43%) และ method precision (36%) สวน bias หรือ recovery (8%), standard concentration (6%) และ sample weight (3%) และองคประกอบอื่นๆ นั้นถือ เปนองคประกอบที่นอยมาก ดังแสดงในภาพที่ 8

ภาพที่ 7 แผนภูมิแทง ME (%) ของ fipronil และเมตาโบไลต

ภาพที่ 8 สัดสวนขององคประกอบแหลงความไมแนนอนของการวิเคราะหสารฟโพรนิลในไขไก ที่ระดับ 0.005 mg/kg (C0 = calibration curve)

60

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

ผลการทวนสอบความใช ไ ด ข องวิ ธี ที่ พั ฒ นาขึ้ น กอนนำไปใชงาน ซึ่งตองสามารถใหผลการวิเคราะหที่ ถูกตอง พบวาเมื่อนำวัสดุควบคุมคุณภาพในตัวกลาง matrix quality control material, QCM Product Code FCPM11-EGG2QC ที่ผลิตโดย FAPAS® ซึง่ ทราบคาทีแ่ นนอนของ fipronil-sulfone ใน chicken (hens) eggs เปน 12.0 μg/kg ชวงยอมรับอยูระหวาง 6.7–17.3 μg/kg ผลการวิเคราะห fipronil-sulfone

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

เปน 11.0μg/kg ซึ่งอยูในชวงยอมรับได จากนั้นทดสอบ IQC โดยการศึกษาการคืนกลับ ผลพบวา %recovery อยู ในเกณฑยอมรับที่ 70–120% ผลการสำรวจเบื้องตน พบ วาเมื่อใชวิธีที่พัฒนาขึ้นและผานการทดสอบความใชได ของวิธีวิเคราะหแลว ตรวจสอบไขและผลิตภัณฑจำนวน 66 ตัวอยาง ทีเ่ ก็บจากกรุงเทพมหานครและปริมณฑลในป พ.ศ. 2564 ผลไมพบการตกคางของสารฟโพรนิลและ เมตาโบไลตในทุกตัวอยาง ดังแสดงในตารางที่ 7

ตารางที่ 7 ผลการตรวจวิเคราะหสาร fipronil และเมตาโบไลต แบงตามประเภทของผลิตภัณฑ Analyte Fipronil-desulfinyl Fipronil Fipronil-sulfone ไขสดชนิดแบงขาย ไมมีบรรจุภัณฑ (n = 18) Not detected Not detected Not detected ไขสดบรรจุในบรรจุภัณฑที่ระบุแหลงผลิต Not detected Not detected Not detected (n = 18) ผลิตภัณฑจากไข (n = 30) Not detected Not detected Not detected ประเภทตัวอยาง

วิจารณ การเตรียมตัวอยางเปนขั้นตอนที่มีความสำคัญ ตอการใหผลการวิเคราะหทถี่ กู ตอง การเตรียมตัวอยางไข ใหเปนเนื้อเดียวกัน (homogenization) ทำไดงายกวา การเตรียมตัวอยางผักผลไม เนื่องจากตัวอยางมีสถานะ เปนของเหลว การวิจยั นีไ้ มไดทำการวิเคราะหสารฟโพรนิล ที่อาจตกคางหรือเคลือบที่เปลือกไข แตจะทำการตรวจ วิเคราะหเฉพาะสวนที่บริโภคไดเพื่อใหสอดคลองกับ มาตรฐานการเตรี ย มตั ว อย า ง (21) สำหรั บ การสกั ด ใช acetonitrile ที่มีความเปนขั้วระดับกลางสามารถละลาย สารฟโพรนิลและเมตาโบไลตไดดี และมีคุณสมบัติทำให โปรตี น ในตั ว อย า งเสื่ อ มสภาพและจั บ ตั ว กั น เป น ก อ น แยกออกจากสวนอื่นๆ (protein precipitation) การ สกัดควรใชการเขยาในแนวตั้งของ centrifuge tube และเขยาดวยมืออยางแรง สามารถใชเครื่องเขยาแบบ mechanic แทนได โดยใสแทงเซรามิกเพื่อชวยในการ ทำใหกอ นโปรตีนแตกตัวไดดขี นึ้ หากเขยาไมแรงเพียงพอ กอนตัวอยางจะติดทีห่ ลอดพลาสติกทำใหไมสามารถสกัด

สารออกมาได หลังจากไดสารสกัดแลว ใช dispersive SPE ในการทำใหบริสุทธิ์(22) ซึ่งมีสวนผสมสำคัญ คือ C18EC สารนี้มีคุณสมบัติดูดซับไขมันไดดี จึงเปนการ กำจั ด ไขมั น จากตั ว อย า งผลิ ต ภั ณ ฑ จ ากสั ต ว ไ ด อ ย า งมี ประสิทธิภาพ เนื่องจากสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตเปนสาร ระเหยได เ มื่ อ ถู ก ความร อ นและคงตั ว ที่ อุ ณ หภู มิ สู ง จึงสามารถใชเครื่องมือชนิด gas chromatograph สำหรับแยกและวิเคราะหสารได สารฟโพรนิลเปนสารทีม่ ี electron สามารถตรวจวัดดวยตัวตรวจวัดชนิด electron capture detector (ECD) ซึ่งเปนเครื่องมือพื้นฐาน ที่ใชในหองปฏิบัติการสำหรับวิเคราะหสารเคมีปองกัน กำจัดศัตรูพืชที่มี electron ในกลุม organochlorine (OC) ดังนั้นเบื้องตนคณะผูวิจัยจึงไดทดลองฉีดสาร มาตรฐานเพื่อวิเคราะหดวยเครื่อง GC-ECD พบวา เครื่องมือนี้มี selectivity และ sensitivity ที่ดี สามารถ ตรวจวัดไดระดับต่ำมากที่ 0.0002 mg/mL (0.2 ppb) และสามารถแยกสารสนใจออกจากกันไดอยางชัดเจน ในขั้ น ตอนการทดสอบความเป น เส น ตรงของกราฟ วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

61

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

มาตรฐาน พบวาชวงความเปนเสนตรงอยูที่ระดับความ เขมขนต่ำ ในชวงแคบระหวาง 0.0002–0.005 mg/mL เทานั้น และเมื่อความเขมขนสูงขึ้น ECD detector จะอิ่ ม ตั ว (saturated) ทำให ก ราฟมี ลั ก ษณะโค ง ที่ ความเขมขนสูง จึงไมสามารถใชงานในชวงการวิเคราะห ที่ ย าวครอบคลุ ม ค า กำหนดได ดั ง แสดงในภาพที่ 9

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

ดวยคุณสมบัติดานความไว (sensitivity) ที่ดี จึงนำมา ประยุ ก ต ใ ช ใ นการตรวจแบบคั ด กรอง (screening method) ที่ระดับต่ำมากไดและหากตรวจพบเบื้องตน จึงทำการตรวจวิเคราะหเชิงปริมาณดวยเทคนิค single point calibration หรื อ ใช เ ครื่ อ ง GC-MS/MS ในลำดับตอไป

ภาพที่ 9 Chromatogram ที่ไดจากเครื่อง ECD ของ method blank (a) fipronil และ metabolites (b) และ กราฟมาตรฐาน ในขั้นตอนการพัฒนาและการทดสอบความใชได ของวิธีวิเคราะหนั้น ดำเนินการไดตรงตามวัตถุประสงค กล า วคื อ parameters ต า งๆ ที่ ท ำการทดสอบมี คุ ณ ลั ก ษณะและคุ ณ สมบั ติ อ ยู ใ นเกณฑ ย อมรั บ ตาม pesticide analytical guideline ของสหภาพยุโรป SANTE/12682/2019 สามารถนำวิธีนี้ไปใชในหอง ปฏิบตั กิ ารได ทัง้ นีห้ ากหองปฏิบตั กิ ารมีประสบการณดา น การเตรียมตัวอยางดวยวิธี QuEChERS ในการวิเคราะห ผักและผลไมอยูแ ลว สามารถนำวิธนี ไี้ ปประยุกตใชไดโดย ปรับเพียงขั้นตอนการเลือก dispersive SPE ที่เหมาะสม สำหรั บ ขั้ น ตอนที่ ส ำคั ญ และมี ค วามท า ทายที่ สุ ด คื อ การหาสภาวะทีเ่ หมาะสมของเครือ่ งมือวิเคราะห และการ ตรวจวัดที่ระดับต่ำมาก 2–5 สวนในพันลานสวน (ppb)

62

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

ทั้งนี้เครื่องมือที่เลือกใช คือ GC-MS/MS จะตอบ สนอง detection limit ได เนื่องจากเปนเครื่องมือที่มี ประสิทธิภาพสูง จากการวิเคราะหแบบ SRM โดยการ เลือก mass transition จำเพาะของสารและเครื่องมือ จะตรวจจับเฉพาะสารสนใจโดยไมมี interferences อื่น ปนเปอนในระบบ วิธีนี้ชวยเพิ่ม sensitivity ใหสามารถ ตรวจที่ระดับต่ำมากได การใช mass ของ 2 products ion จากเครือ่ ง GC-MS/MS ชนิด triple quadrupole ให degree of selectivity ซึ่งใชในการประเมินความ เชื่อมั่นในการระบุชนิดสารสูงตรงตามมาตรฐานและเปน ที่ยอมรับในระดับสากลโดยไมตองมีการยืนยันเพิ่มเติม อุปสรรคที่พบระหวางการดำเนินงาน คือ ประสบ ปญหาที่ไมสามารถควบคุมไดในชวงการเก็บตัวอยาง

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ

ในเขตพื้ น ที่ ก ารระบาดของโรคติ ด ต อ อุ บั ติ ใ หม (COVID-19) อย า งรุ น แรงในช ว งธั น วาคม 2563 ถึ ง เมษายน 2564 ทำให ภ าครั ฐ ต อ งออกมาตรการ หามเขาถึงพื้นที่เปาหมายของการเก็บตัวอยาง ไดแก กรุงเทพมหานครและปริมณฑล และเพื่อความปลอดภัย ของคณะผูวิจัยจึงตองมีการปรับแผนในการเก็บตัวอยาง ออกไป 1–2 เดือน เพือ่ รอจนกวาสถานการณจะคลีค่ ลายลง แตเนื่องจากพื้นที่เปาหมายเปนพื้นที่ใกลเคียงกับหอง ปฏิบัติการในรัศมีไมเกิน 100 กิโลเมตร หลังจากมีการ ผอนคลายมาตรการลง จึงจะเขาเก็บตัวอยางในพื้นที่ เปาหมายไดอยางรวดเร็วและดำเนินการตามแผนที่วาง ไวจนสำเร็จ ผลการสำรวจเบื้องตนไมพบการตกคางของ สารฟโพรนิลและเมตาโบไลตในทุกตัวอยาง ทำใหทราบ สถานการณเบื้องตนของการตกคางของสารฟโพรนิลใน อาหารในเขตพืน้ ทีเ่ ปาหมาย ซึง่ บงชีว้ า ณ บริเวณทีส่ ำรวจ ตัวอยางไมมีการตกคางของสารสนใจในระดับที่จะกอให เกิดอันตราย และสถานทีผ่ ลิตไมมกี ารใชงานสารฟโพรนิล ผิดวัตถุประสงคในฟารมเลี้ยงสัตว ซึ่งผลการวิเคราะหนี้ สะทอนความปลอดภัยของอาหารเฉพาะสวนที่บริโภคได เทานัน้ หากตองการศึกษาเพิม่ เติมการใชสารในการกำจัด ไรในฟารมไกหรือไม อาจมีการตรวจเพิม่ เติมการวิเคราะห ในสวนเปลือกไขไดดวย ขอมูลดังกลาวนี้สามารถใชสราง ความมัน่ ใจแกผบู ริโภคไขและผลิตภัณฑมคี วามปลอดภัย ตอการบริโภค อาจมีการขยายผลเพื่อจัดทำโครงการ สำรวจติดตามในวงกวางครอบคลุมทั้งประเทศตอไปได สำหรับการควบคุมคุณภาพผลการวิเคราะห เพื่อ ให เ กิ ด ความเชื่ อ มั่ น ต อ งทำการควบคุ ม คุ ณ ภาพ เช น การวิ เ คราะห method blank/reagent blank, spiked sample และ duplicate sample ทุกชุดของ การสกัด (batch) หรืออยางนอย 10% ของตัวอยาง และเนื่องจาก MS detector เปนเครื่องมือตรวจวัดที่ sensitivity สามารถเกิดการเปลี่ยนแปลงไดตามระยะ เวลาการใชงาน จึงตองมีการตรวจสอบ instrument drift ดวยเสมอ โดย response ใน analytical batch เดียวกัน จะตองแตกตางกันไมเกิน 30% และหากพบสาร ที่สงสัยวาเปนสารสนใจจะตองทำการตรวจยืนยันดวย ทุกครั้งการยืนยันชนิดของสารที่ตรวจพบตองยืนยันผล ดวย ion intensities ratio โดยคา ion intensities

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

ratio ของสารที่ วิ เ คราะห แ ต ล ะตั ว ในตั ว อย า ง และ ion intensities ratio เฉลี่ยของสารมาตรฐานนั้น จะตองแตกตางกันไมเกิน 30% หรือใชวิธีทางเลือกอื่น (alternative method) เช น GC-ECD หรื อ LC-MS/MS เปนตน และยืนยันปริมาณที่ตรวจพบ โดยทำการทดสอบตั ว อย า งใหม (retest) แบบ duplicate test รายงานโดยใชคาเฉลี่ยของการทำซ้ำ และเกณฑยอมรับของ %RPD ตองไมเกิน 25% เปนการ ยืนยันวากระบวนการวิเคราะหทั้งหมดมีความถูกตอง เหมาะสมและสอดคลองกับเอกสารอางอิงและมาตรฐาน ห อ งปฏิ บั ติ ก ารทดสอบและสอบเที ย บ ISO/IEC 17025:2017 จากปญหาตั้งตนที่สหภาพยุโรปพบไขจำนวนมาก ถูกปนเปอนดวยสารฟโพรนิล ซึ่งเปนสารเคมีที่หามใช ในฟารมเลี้ยงสัตวที่ใชเปนอาหาร ทำใหตองสั่งปดฟารม เลี้ยงไกจำนวนมากเพื่อดำเนินการตรวจสอบ และตอง ระงับการขายและเรียกคืนไขเพื่อนำไปทำลายทิ้ง เรื่อง ดังกลาวบงชี้วาแมกลุมประเทศพัฒนาแลวและมีความ เขมขนของการตรวจสอบสินคาอาหารจากตางประเทศ ที่จะนำเขามาจำหนายภายในประเทศสมาชิก แตกลับ มีมาตรการที่หละหลวมตอการตรวจสอบภาคการผลิต ภายในสหภาพยุโรปเอง ในสวนของประเทศไทยซึ่งเปน ประเทศผูผลิตอาหารรายใหญของโลกและมีการสงออก สินคาเกษตรเปนมูลคามหาศาล จำเปนตองมีหนวยงาน ที่ดูแลดานความปลอดภัยของอาหาร ดำเนินการตรวจ สอบสินคาที่มีวางจำหนายอยางสม่ำเสมอและตอเนื่อง อยางเปนระบบ ภาครัฐตองใหการสนับสนุนทรัพยากร ที่ เ พี ย งพอต อ การสำรวจติ ด ตาม ซึ่ ง จะเป น ประโยชน โดยตรงตอประชาชนตอการดำรงไวซึ่งสุขภาพที่ดี ลด คาใชจายทางการแพทยและการสาธารณสุข ในสวนของ ภาคการผลิตนอกจากจะตองมีการใหความรูดานการใช สารเคมีอยางถูกตองในภาคเกษตรกรรมแลว ยังตอง มีการกำกับดูแลอยางเขม งวดจากหนวยงานตน น้ ำใน ขัน้ ตอนการผลิต ตรวจสอบความปลอดภัยสินคาหนาฟารม กอนวางจำหนาย ผลการสำรวจเบื้องตนของโครงการ แสดงใหเห็นวาไขและผลิตภัณฑจากไขที่จำหนายในเขต กรุงเทพมหานครและปริมณฑลยังคงมีความปลอดภัย และเพื่อเปนการรักษาระดับคุณภาพสินคาที่จำหนายใน วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

63

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

ทองตลาด จำเปนตองมีการวิเคราะหสารตกคางทั้งจาก ฟารมผูผลิตกอนนำออกจำหนาย ผูผลิตรายใหญที่มีหอง ปฏิบตั กิ ารสามารถนำวิธที พ่ี ฒ ั นาขึน้ นีไ้ ปใชในหองปฏิบตั กิ าร เพื่ อ ควบคุ ม คุ ณ ภาพสิ น ค า ของตนได และหน ว ยงาน กำกับดูแลดานกฎหมายตองมีแผนการเก็บตัวอยางอยาง สม่ำเสมอและตองไดรบั การสนับสนุนทรัพยากรจากหนวย งานที่เกี่ยวของอยางตอเนื่องดวย

สรุป วิธีทดสอบที่ไดจากการพัฒนาและทดสอบความ ใชไดของวิธีวิเคราะหมีคุณสมบัติเหมาะสม สอดคลอง กั บ มาตรฐานและกฎหมายของประเทศไทย ได แ ก ประกาศกระทรวงสาธารณสุข ฉบับที่ 387 พ.ศ. 2560 เรื่ อ ง อาหารที่ มี ส ารพิ ษ ตกค า ง และมาตรฐานระดั บ นานาชาติตามโครงการมาตรฐานอาหารระหวางประเทศ (Codex Alimentarius) สามารถใช เ ป น วิ ธี ก าร ทดสอบที่ใหบริการของหนวยงาน และเพื่อใชในการ สำรวจติดตามเพื่อประเมินสถานการณการตกคางของ สารพิษได ผลการสำรวจสินคาไขและผลิตภัณฑจากไข ที่ จ ำหน า ยในเขตกรุ ง เทพมหานครและปริ ม ณฑล ไม พ บสาร fipronil และเมตาโบไลต ต กค า งในทุ ก ตั ว อย า ง สามารถสร า งความมั่ น ใจแก ผู บ ริ โ ภคได ระดับหนึ่ง รวมถึงการเฝาระวังความปลอดภัยจำเปน ตองดำเนินการอยางเปนระบบและตอเนื่อง เพื่อสราง ความเชื่อมั่นใหแกผูบริโภคและประเทศคูคา

กิตติกรรมประกาศ งานวิจยั นีไ้ ดรบั ทุนสนับสนุนจากกรมวิทยาศาสตร การแพทย ภายใตโครงการพัฒนาขีดความสามารถและ เครือขายหองปฏิบัติการดานอาหารเพื่อความมั่นคงดาน สุขภาพ

เอกสารอางอิง 1. Lecoq M, Balança G. Field trials of fipronil for control of Rhammatocerus schistocercoides (Rehn, 1906) hopper bands in Brazil. Crop Protection 1998; 17(2): 105-110.

64

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol 2. Kaur R, Mandal K, Kumar R, Singh B. Analytical method for determination of fipronil and its metabolites in vegetables using the QuEChERS method and gas chromatography/mass spectrometry. Journal of AOAC International 2015; 98(2): 464-471. 3. Jackson D, Cornell CB, Luukinen B, Buhl K, Stone D. Fipronil Technical Fact Sheet; National Pesticide Information Center, Oregon State University Extension Services. [online]. [cited 2021 Oct 2]; [13 screens]. Available from: URL: http://npic.orst.edu/factsheets/archive/ fiptech.html 4. World Health Organization. The WHO recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to classification: 2004. [online]. [cited 2021 Oct 2]; [60 screens]. Available from: URL: https://www.who.int/ipcs/publications/ pesticides_hazard_rev_3.pdf 5. Lia X, Mab W, Lia H, Zhanga Q, Mac Z. Determination of residual fipronil and its metabolites in food samples: A review. Trends in Food Science & Technology 2020; 97(1): 85-195. 6. Gunasekara AS, Truong T, Goh KS, Spurlock F, Tjeerdema RS. Environmental fate and toxicology of fipronil. Journal of Pesticide Science 2007; 32(3): 189-199. 7. Brennan AA, Harwood AD, You J, Landrum PF, Lydy MJ. Degradation of fipronil in anaerobic sediments and the effect on porewater concentrations. Chemosphere 2009; 77(1): 22-28. 8. Qu H, Ma RX, Liu DH, Jing X, Wang F, Zhou ZQ, et al. The toxicity, bioaccumulation, elimination, conversion of the enantiomers of fipronil in Anodonta woodiana. Journal of Hazardous Materials 2016; 312: 169-174. 9. Charalampous AC, Liapis KS, Bempelou ED. Fipronil in eggs. Is LC-MS/MS the only option? A comparison study of LCMS/MS and GC-ECD for the analysis of fipronil. Journal of Chromatography B 2019; 1129(2019): 121785.

การวิเคราะหสารฟโพรนิลและเมตาโบไลตตกคางในไขและผลิตภัณฑ 10. Shen W, Liu H, Zhang R, Yu K, Cai L, Li, Y, Wang H. Determination of fipronil and its metabolites in eggs and egg products with gas chromatography-negative chemical ionizationmass spectrometry. Chinese Journal of Chromatography 2017; 35(12): 1224-1228. 11. Wittayanan W, Srikote R, Chaimongkol T. Determination of Organochlorine Pesticide and Polychlorinated Biphenyl as POPs Residues in Freshwater Animals in Thailand during 2017-2018. Science & Technology Asia 2019; 24(3): 27-38. 12. Wittayanan W, Chaimongkol T. Determination of pesticides residue in cannabis, cannabis extract and cannabis oil by gas chromatography tandem mass spectrometry technique. Pharm Sci Asia 2021; 48(4): 354-366. 13. Anagnostopoulos C, Ampadogiannis G, Bempelou E, Liapis K, Kastellanou E. The 2017 fipronil egg contamination incident: The case of Greece. Journal of Food Safety 2019; 2020;40:e12727. https://doi.org/10.1111/ jfs.12727. 14. Reich H, Triacchini GA. Occurrence of residues of fipronil and other acaricides in chicken eggs and poultry muscle/fat. European Food Safety Authority Journal 2018; 16(5): 30. https://doi. org/10.2903/j.efsa.2018.5164. 15. Commission Regulation (EU) No 1127/2014 of 20 October 2014 amending Annexes II and III to Regulation (EC) No 396/2005 of the European Parliament and of the Council as regards maximum residue levels for amitrole, dinocap, fipronil, flufenacet, pendimethalin, propyzamide, and pyridate in or on certain products. (pp. 47–99). OJ L 305.

วีรวุฒิ วิทยานันท และ ธรณิศวร ไชยมงคล

16. Codex Alimentarius International Food Standard. (2021). Codex Pesticides Residues in Food Online Database. [online]. [cited 2021 Oct 2]; [2 screens]. Available from: URL: http:// www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/ codex-texts/dbs/pestres/en/ 17. Ministry of Public Health Notification. No. 387 B.E. 2560 Re: Food Containing Pesticide Residues (Pesticide Residues in Food). Government Gazette 2017; 138(228ng): 8-33. 18. Department of Medical Science. Regulations of the Department of Medical Sciences on analysis and service rate. Government Gazette 2020; 137(98ng): 1-18. 19. Eurachem. EURACHEM/CITAC Guide CG 4. Quantifying uncertainty in analytical measurement, 3rd ed [online]. 2012. [cited 2021 Oct 2]; Available from: URL:https:// www.eurachem.org/images/stories/Guides/ pdf/QUAM2012_P1.pdf 20. Ferrer C, Lozano A, Agüera A, Girón AJ, Fernández-Alba AR. Overcoming matrix effects using the dilution approach in multiresidue methods for fruits and vegetables. J Chromatogr A 2011; 1218(42): 7634-7639. doi: 10.1016/j. chroma.2011.07.033. 21. Thai Agricultural Standard. Methods of sampling for the determination of pesticide residues TAS 9025-2008. National Bureau of Agricultural Commodity and Food Standards, Ministry of Agriculture and Cooperatives, CS 03.120.30. 22. Gonzalez-Curbelo MA, Socas-Rodriguez B, Herrera-Herrera AV, Gonzalez-Salamo J, Hernandez-Borges J, Rodriguez-Delgado MA. Evolution and applications of the QuEChERS method. TRAC Trends in Analytical Chemistry 2015; 71: 169-185.

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

65

Analysis of Fipronil and Its Metabolite in Eggs and Products

Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol

Method Development and Validation for the Determination of Fipronil and Its Metabolite Residues in Eggs and Products Weerawut Wittayanan and Thoranit Chaimongkol Bureau of Quality and Safety of Food, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand

ABSTRACT Fipronil is an insecticide whose degradation products are highly neurotoxic for humans.

In Thailand, fipronil is approved to use for plant protection but not as a veterinary drug. It was found that, egg contamination by fipronil in Europe in 2017 has generated concerns in Thai consumers. Thus, an analytical method is required for the investigation of the fipronil residues in commercialized egg and egg products in Thailand. Fipronil was extracted by a developed procedure based on EN 15662:2018 QuEChERS, detected by selected reaction monitoring techniques in GC-MS/MS and quantified by matrix-matched calibration curve. The validation of the method to detect fipronil and two metabolites, fipronil-desulfinyl, and fipronil-sulfone, in chicken and duck eggs showed that the LOD and the LOQ were 0.002 and 0.005 mg/kg, respectively. Satisfactory recoveries were obtained in the range of 92.9–111.6% in spiked samples at 0.005, 0.05 and 0.1 mg/kg with RSD lower than 8.6%. The relative standard uncertainty value was less than 20% and the method working ranges were between 0.005–0.5 mg/kg which were acceptable. This method was sensitive, precise, reliable, and suitable for use in the laboratory. The validated method was further applied for the analysis of 66 egg and egg product samples collected from Bangkok Metropolitan Region in 2021. The result showed no detectable fipronil residues in any samples. Overall results indicated that the described method would be applied for detecting the fipronil and its metabolite residues in the future. Keywords: Fipronil, Eggs, GC-MS/MS, Method development and validation

66

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

บทความทั่วไป

ว กรมวิทย พ 2565; 64 (1): 67-80

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญ หองปฏิบตั กิ ารของสำนักยาและวัตถุเสพติด ศิริพร เหลามานะเจริญ มาศวลัย ลิขิตธนเศรษฐ และ อังคณา กริชพิทักษเงิน สำนักยาและวัตถุเสพติด กรมวิทยาศาสตรการแพทย นนทบุรี 11000

บทคัดยอ สํานักยาและวัตถุเสพติด เปนผูจัดการทดสอบความชํานาญหองปฏิบัติการดานยาและยาเสพติด มีวัตถุประสงค

เพื่อใชประเมินความสามารถของหองปฏิบัติการทดสอบ และเปนหลักฐานแสดงถึงความนาเชื่อถือผลการทดสอบของ หองปฏิบัติการ การดําเนินงานในระยะแรกติดตอประสานงานกับสมาชิกผานหนังสือราชการสงทางไปรษณียและโทรสาร พบปญหาการสูญหายของเอกสาร การเสียคาใชจายจัดทําและจัดสงเอกสารจํานวนมาก และความยุงยากในการบริหาร จัดการและจัดเก็บเอกสารในรูปแบบกระดาษ ในป พ.ศ. 2560 และ 2561 ไดพัฒนาการดําเนินงานโดยใชเว็บไซตและ แอปพลิเคชันตามลําดับ จากขอมูลการดําเนินงานจัดการทดสอบระหวางป พ.ศ. 2560 ถึง 2563 พบวาคาใชจายในการจัด ทําเอกสารและคาขนสง ปริมาณการใชกระดาษและระยะเวลาที่ใชในการจัดการเอกสาร เปรียบเทียบระหวางการใชและไม ใชเว็บไซตในการดําเนินงาน มีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญทางสถิติโดยใช paired sample t-test (p < 0.05) เมื่อ เปรียบเทียบความพึงพอใจของสมาชิกตอเว็บไซตในแตละป (พ.ศ. 2560-2563) พบวาไมแตกตางกัน สมาชิกมีความ พึงพอใจมากที่สุด เรื่องการมีระบบความปลอดภัยโดยการใชรหัสผาน เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชํานาญ หองปฏิบัติการสํานักยาและวัตถุเสพติด ชวยใหการดําเนินงานมีความสะดวก รวดเร็ว และลดคาใชจายในการดําเนินงาน นอกจากนี้ชวยสงเสริมการดําเนินงานที่เปนมิตรตอสิ่งแวดลอม และมีความปลอดภัยในสถานการณการแพรระบาดของ โรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ดวยการลดการสัมผัส สามารถสรางภาพลักษณท่ีดีในการดําเนินงานและมีความทันสมัย ดวยการใชเทคโนโลยีสารสนเทศสอดคลองกับนโยบายไทยแลนด 4.0 คําสําคัญ : การทดสอบความชํานาญ, เว็บไซต, แอปพลิเคชัน, สํานักยาและวัตถุเสพติด

Corresponding author E-mail: [email protected] Received: 16 August 2021 Revised: 6 February 2022

Accepted: 28 February 2022

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

67

Proficiency Testing Website and Application

บทนํา ในอดีต ประเทศไทยไมมีหนวยงานที่ใหบริการ ทดสอบความชำนาญดานยาและยาเสพติด หองปฏิบัติ การจึงตองเขารวมกิจกรรมจากตางประเทศที่มีคาใชจายสูง และเปนอุปสรรคสำหรับหองปฏิบัติการจากภาครัฐหรือ หนวยงานขนาดเล็กที่ตองการประเมินความสามารถและ เพื่อประกันคุณภาพหองปฏิบัติการ สำนักยาและวัตถุ เสพติดมีภารกิจตามกฎหมาย คือ เปนหองปฏิบัติการ อางอิงระดับชาติ มีหนาที่สงเสริมและสนับสนุนกิจกรรม เพือ่ พัฒนาศักยภาพหองปฏิบตั กิ ารตรวจวิเคราะหยา หอง ปฏิบัติการตรวจสารเสพติดในปสสาวะและสถานตรวจ พิสจู นยาเสพติดภายในประเทศ เห็นถึงความสำคัญเรือ่ ง นี้ จึงริเริ่มเปนผูจัดบริการทดสอบความชำนาญในแผน งานดานยาและยาเสพติดตัง้ แตป พ.ศ. 2546 สาเหตุทกี่ าร ทดสอบความชำนาญมีความสำคัญ เนื่องจากหองปฏิบัติ การที่จัดทำระบบคุณภาพหองปฏิบัติการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2017 และตองขอรับการรับรองความ สามารถหองปฏิบัติการ ตองเขารวมการทดสอบความ ชำนาญ (Proficiency testing: PT)(1) เพื่อเปนการ ประเมินความสามารถของหองปฏิบัติการทดสอบ และ เปนหลักฐานแสดงถึงความนาเชื่อถืออยางเปนรูปธรรม สามารถสะท อ นได ว า ห อ งปฏิ บั ติ ก ารนั้ น มี ก ารพั ฒ นา ปรับปรุงการปฏิบัติงานตางๆ อยางตอเนื่อง ปจจุบันมีสมาชิกทั้งภายในและภายนอกประเทศ ทั้งภาครัฐและเอกชนจำนวนประมาณ 1,300 แหง เปด ใหบริการทดสอบความชำนาญ จำนวน 4 แผนงาน คือ ดานยา ดานสารเสพติดในปสสาวะ ดานยาเสพติดให โทษในของกลาง และดานวัตถุออกฤทธิ์ในของกลาง โดย ดานยามีหนวยงานในประเทศภูมิภาคอาเซียนเขารวม กิ จ กรรมด ว ย ในแต ล ะป เ ป ด ให บ ริ ก ารทดสอบความ ชำนาญ 6-10 โปรแกรม ซึ่ ง ได รั บ การรั บ รองอย า ง ตอเนือ่ งและขยายขอบขายการรับรองการเปนผูจ ดั บริการ ทดสอบความชำนาญตามมาตรฐานสากล ISO/IEC 17043:2010(2) เมื่อมีการทบทวนระบบบริหารคุณภาพ (management review) พบวางานดานระบบคุณภาพ มีการพัฒนาอยางตอเนือ่ ง และงานดานบริการยังมีโอกาส พัฒนาได การบริหารจัดการงานบริการทดสอบความ ชำนาญ มี ก ระบวนการที่ ต อ งสื่ อ สารเพื่ อ ให ข อ มู ล กั บ

68

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siriphorn Laomanacharoen et al.

สมาชิก โดยสามารถดำเนินการผานสื่อตางๆ ที่มีความ เหมาะสม เชน การสื่อสารในรูปแบบอิเล็กทรอนิกส(3) จากการที่ ส ำนั ก ยาและวั ต ถุ เ สพติ ด เป น สมาชิ ก กั บ ผูใหบริการทดสอบความชำนาญมาอยางตอเนื่อง ซึ่ง เป น หน ว ยงานจากต า งประเทศ เช น European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (EDQM)(4) และ United Nation Office on Drugs and Crime (UNODC)(5) พบวามีการใช เทคโนโลยีสารสนเทศในการสื่อสารกับสมาชิกและการ เขาถึงขอมูลผานระบบเว็บไซต (website) ในขั้นตอน การประชาสั ม พั น ธ โ ปรแกรมการทดสอบ ส ง ผลการ ทดสอบ และการดาวนโหลด (download) รายงานผลการ ทดสอบ ในป พ.ศ. 2559 เริม่ พัฒนาระบบบริการทดสอบ ความชำนาญของสำนักยาและวัตถุเสพติด จากการดำเนิน งานและสื่อสารกับสมาชิกในรูปแบบกระดาษเอกสาร ผ า นทางขนส ง ไปรษณี ย แ ละทางโทรสาร เปลี่ ย นเป น รูปแบบเว็บไซตเต็มรูปแบบ ตั้งแตการรับสมัครจนถึง ดาวนโหลดใบประกาศนียบัตร เพือ่ ใชงานกับคอมพิวเตอร แบบตั้ ง โต ะ และโน ต บุ ก คอมพิ ว เตอร (notebook computer) รวมถึงพัฒนาแอปพลิเคชัน (application) ควบคูกันไป สามารถใชงานบนโทรศัพทเคลื่อนที่แบบ สมารตโฟน (smart phone) และแท็บเล็ต (tablet) โดย เปดใชเว็บไซตและแอปพลิเคชันอยางเปนทางการในป พ.ศ. 2560 และ 2561 ตามลำดับ และมีการปรับปรุง พัฒนาอยางตอเนื่องทุกป (พ.ศ. 2560-2563) เพื่อ เปนการเขาถึงผูรับบริการและสามารถเลือกใชงานตาม ความสะดวก โดยขอมูลสามารถเชื่อมโยงและจัดเก็บที่ เดียวกัน ซึง่ ปจจุบนั ควรมีรปู แบบการใหบริการทีส่ นับสนุน ผูใชงานใหสามารถทำงานไดทุกที่ทุกเวลา เปนการตอบ สนองความตองการและสรางความพึงพอใจใหผรู บั บริการ ตามนโยบายไทยแลนด 4.0

วัสดุและวิธีการ การจั ด ทำเว็ บ ไซต แ ละแอปพลิ เ คชั น เพื่ อ เป น ตัวกลางในการสือ่ สารและดำเนินงานบริการทดสอบความ ชำนาญของสำนักยาและวัตถุเสพติด กลุมผูใชงานหลัก คือ สมาชิกหองปฏิบัติการทดสอบความชำนาญ ซึ่งเปน

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ

กลุม เฉพาะของแตละแผนงาน รูปแบบการเขาถึงกระบวน งานทดสอบความชำนาญ เปนการแยกชองทางการเขาถึง โดยเลือกผานเมนู และกำหนดสีที่แตกตางกันในแตละ แผนงาน นอกจากนี้มีเมนูหรือพื้นที่ประชาสัมพันธและ แจง ขาวสารสมาชิกทราบ โดยมีองคประกอบของเนื้อหา และคุ ณ ลั ก ษณะเป น ไปตามมาตรฐานเว็ บ ไซต ภ าครั ฐ (Government Website Standard)(6, 7) มีระบบ การดำเนินงานจัดบริการทดสอบความชำนาญที่สามารถ ติดตอสื่อสารและแจงสมาชิกทราบรายละเอียดในแตละ ขั้นตอ เชน การรับสมัครเขารวมทดสอบ การสงตัวอยาง ทดสอบ การสงผลทดสอบ การสงรายงานผลการทดสอบ และการรักษาความลับของสมาชิกใหเปนไปตามมาตรฐาน สากล ISO/IEC 17043:2010(2) การออกแบบและพัฒนาเว็บไซตและแอปพลิเคชัน ดำเนินการโดยรวบรวมขอมูลตางๆ จากขั้นตอนแรก ประเมินและวางระบบ เพื่อใหไดโครงสรางขอมูล นำไป สรางแผนผังเว็บไซตและแอปพลิเคชัน รูปแบบของเมนู ระบบการเขาถึงขอมูลสวนบุคคล ขั้นตอนการดำเนินงาน แบบฟอร ม อิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส การจั ด รู ป แบบและองค ประกอบของภาพและกราฟฟกที่เหมาะสม ระบบจัดการ เว็บไซตหรือระบบหลังบาน (back-office) ที่ใชบริหาร จัดการขอมูล และระบบการตั้งสิทธิการเขาถึงเพื่อบริหาร จัดการระบบหลังบาน โดยมอบหมายงานใหผูรับจาง ดำเนินการจัดทำเว็บไซตและแอปพลิเคชันตามระบบที่ วางไว ดำเนินการตรวจสอบ แกไข และทดลองระบบ เพื่อใหมั่นใจวาสามารถใชงานได การประชาสั ม พั น ธ เ ผยแพร เ ว็ บ ไซต แ ละ แอปพลิเคชันและเปดการใชงานในการประชุมสัมมนา สมาชิกประจำป โดยประชาสัมพันธใหสมาชิกทราบผาน ทางหนังสือราชการและไปรษณียอิเล็กทรอนิกส การสำรวจความพึงพอใจการใหบริการทดสอบ ความชำนาญ ดำเนิ น การผ า นทางเว็ บ ไซต แ ละ แอปพลิเคชันเปนประจำทุกป จากหองปฏิบัติการตรวจ วิ เ คราะห ที่ ส มั ค รเป น สมาชิ ก เข า ใช ง านเว็ บ ไซต แ ละ แอปพลิ เ คชั น และเข า ร ว มการทดสอบความชำนาญ โดยสำรวจความพึงพอใจทั้งความเหมาะสมของรูปแบบ และความสะดวกในการใชงาน ประเมินผลโดยใชสถิติ ไคสแควร (χ2-test) พิจารณาความแตกตางทางสถิติที่ ระดับ p < 0.05

ศิริพร เหลามานะเจริญ และคณะ

การประเมินความคุมคาของการใชเว็บไซตและ แอปพลิเคชัน ดำเนินการโดยการรวมขอมูลการทดสอบ ความชำนาญระหวางป พ.ศ. 2560-2563 ในดานคาใชจา ย ในการจั ด ทำเอกสารและการขนส ง ทางไปรษณี ย , ปริมาณการใชกระดาษ และระยะเวลาที่ใชในการจัดการ เอกสารสำหรับจัดสงไปรษณีย โดยเปรียบเทียบระหวาง การดำเนินงานแบบใชและไมใชเว็บไซต ประเมินความคุม ค า ของการใช เ ว็ บ ไซต แ ละแอปพลิ เ คชั น คำนวณ คาเฉลี่ยตอปของคาจัดทำเอกสารและคาขนสงไปรษณีย ปริมาณการใชกระดาษ และระยะเวลาที่ใชในการจัดการ เอกสารสำหรับสงไปรษณีย โดยใชสถิติ paired sample t-test พิจารณาความแตกตางทางสถิติที่ระดับ p < 0.05 การบำรุงรักษา ปรับปรุง และพัฒนา ดำเนินการ โดยมีการรวบรวมปญหาที่พบในปที่ผานมา ทั้งในสวน ของเนื้อหา โครงสรางและการออกแบบ เพื่อปรับปรุง ความสะดวกในการใชงานและผูใ ชงานมีความรูส กึ ถึงการ เปลี่ยนแปลงที่ทันสมัยอยูเสมอ ทบทวนและปรับเปลี่ยน ระบบการสำรองขอมูล (backup data) ทีเ่ หมาะสม รวม ทัง้ ความถีใ่ นการสำรอง และปรับปรุงขอมูลใหเปนปจจุบนั

ผล เว็บไซตและแอปพลิเคชันใชในการสื่อสารและ ดำเนินงานบริการจัดการทดสอบความชำนาญ โดยมีกลุม ผูใ ชงานเปนหองปฏิบตั กิ ารตรวจวิเคราะหของ 4 แผนงาน คือ ดานยา ดานสารเสพติดในปสสาวะ ดานยาเสพติด ใหโทษในของกลาง และดานวัตถุออกฤทธิ์ในของกลาง โดยมีชองทางการเขาถึงผานเมนูและกำหนดสีที่แตกตาง กันในแตละแผนงาน คือ ดานยาเปนสีเขียว ดานปสสาวะ เปนสีเหลือง ดานยาเสพติดใหโทษในของกลางเปนสีแดง และดานวัตถุออกฤทธิ์ในของกลางเปนสีน้ำเงิน มีการ ปองกันรักษาความลับโดยใชรหัสผาน (password) กอนเขาสูร ะบบ นอกจากนีม้ พี นื้ ทีป่ ระชาสัมพันธและแจง ขาวสารใหสมาชิกทราบ การแสดงผลเปน 2 ภาษา คือ ภาษาไทยและภาษา อังกฤษ ในลักษณะรูปแบบขอความภาษาอังกฤษกำกับ ดวยภาษาไทย โดยชื่อเมนูใชเครื่องหมายทับ (/) คั่น ระหวางภาษา สวนลางของเว็บไซตทุกๆ หนาแสดงขอมูล ไดแก ชือ่ หนวยงานและทีอ่ ยู หมายเลขโทรศัพทหมายเลข โทรสาร คำสงวนลิขสิทธิ์ (copyright) และหนาแรกของ วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

69

Proficiency Testing Website and Application

เว็บไซต (Home) ดังแสดงในภาพที่ 1 ประกอบดวย i) ชองทางสมัครสมาชิกเว็บไซต (PT register) ii) ชองทางเขาสูระบบเว็บไซต (PT login) iii) เมนูหลัก 6 เมนู ไดแก Home, About us, PT scheme, News&KM, Q&A และ Contact us iv) ทางลัดเขาสูเมนูแผนการทดสอบ v) ทางลัดเขาสูเมนูเกี่ยวกับหนวยงาน (About us)

Siriphorn Laomanacharoen et al.

vi) ชองทางเขาสูการสมัครเขารวมประชุม สัมมนาสมาชิก vii) พื้นที่ประชาสัมพันธขอมูลและขาวสาร viii) เว็บลิงก (web link) ix) ชองทางการสมัครรับจดหมายขาว (E-Newsletter) x) ผังเว็บไซต (Site map)

i

ii

iii

iv

v vi vii viii ix x

ภาพที่ 1 เว็บไซตการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ สำนักยาและวัตถุเสพติด

70

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ

เว็บไซตจดชือ่ โดเมน (Domain name) ในหมวด go.th และตั้งชื่อโดเมน https://bdn.go.th/pt ที่สื่อ ความหมายชื่อของหนวยงาน โดยใชอักษรยอชื่อภาษา อังกฤษของสำนักยาและวัตถุเสพติด (Bureau of Drug and Narcotic: BDN) และงานบริการทดสอบความ ชำนาญ (Proficiency Testing: PT) ซึ่งเปนคำเฉพาะ ที่เขาใจและคุนเคยสำหรับกลุมผูใชงานงายตอการจดจำ เมนู “About us/เกีย่ วกับเรา” มีเมนูยอ ยประกอบ ดวย Our history/ประวัตขิ องเรา แสดงขอมูลความเปน มาจุดเริ่มตนของการจัดงานบริการทดสอบความชำนาญ ของสำนักยาและวัตถุเสพติด, Quality standards/ มาตรฐานคุณภาพ แสดงขอมูลมาตรฐานคุณภาพที่ใชใน การดำเนินงานบริการทดสอบความชำนาญของสำนักยา และวัตถุเสพติด และการไดรับการรับรองตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043:2010, Our team/คณะทำงาน แนะนำผูดำเนินงานบริการทดสอบความชำนาญ เมนู “News & KM/ขาวสารและความรู” มีเมนู ยอยประกอบดวย News/ขาวสาร แสดงขอมูลขาวสาร ประชาสัมพันธทั่วไป กิจกรรมของหนวยงาน และแจง ชองทางการรองเรียนและอุทธรณ โดยสามารถกำหนดให แสดงที่หนาแรกของเว็บไซตได เพื่อใหเขาถึงไดงาย KM /คลังความรู แสดงบทความทั่วไปทางวิชาการ เมนู “Q&A/ถาม-ตอบ” แสดงคำถามและคำตอบ ที่มีผูนิยมสอบถาม โดยทำในรูปแบบซอนคำตอบและ แสดงคำตอบเมื่อคลิกที่คำถามนั้น เมนู “Contact us/ติดตอเรา” แสดงชองทางที่ ผูใ ชบริการสามารถสงขอความสอบถามหรือขอสงสัยมายัง ผูจัดงานบริการทดสอบความชำนาญ สำนักยาและวัตถุ เสพติด และไดรบั คำตอบผานทางไปรษณียอ เิ ล็กทรอนิกส และแสดงข อ มู ล ที่ อ ยู ช อ งทางติ ด ต อ ผู จั ด งานบริ ก าร ทดสอบความชำนาญผานทางโทรศัพท โทรสาร และ ไปรษณียอ เิ ล็กทรอนิกส นอกจากนีแ้ สดงตำแหนงทีต่ งั้ ของ สำนักยาและวัตถุเสพติดในรูปแบบแผนทีภ่ าพและแผนที่ อิเล็กทรอนิกสผาน Google Map เว็บลิงกเชือ่ มตอหนวยงานทีเ่ กีย่ วของและเว็บไซต อื่นที่เกี่ยวของกับการทดสอบความชำนาญ เชน เว็บไซต แผนการทดสอบความชำนาญกรมวิทยาศาสตรการแพทย เว็บไซตกระทรวงสาธารณสุข เว็บไซตสำนักงานคณะ

ศิริพร เหลามานะเจริญ และคณะ

กรรมการอาหารและยา เว็บไซตสำนักงานพิสจู นหลักฐาน ตำรวจ เว็บไซตสถาบันนิติวิทยาศาสตร เว็บไซตกรม ราชทั ณ ฑ เว็ บ ไซต ก รมคุ ม ประพฤติ เว็ บ ไซต ส ถาบั น นิ ติ เ วชวิ ท ยา โรงพยาบาลตำรวจ เว็ บ ไซต ส ำนั ก งาน วาดวยยาเสพติดและอาชญากรรมแหงสหประชาชาติ เว็บไซตสำนักงานคณะกรรมการปองกันและปราบปราม ยาเสพติด และเว็บไซตกรมวิทยาศาสตรบริการ ผังเว็บไซตเปนสวนทีแ่ สดงแผนผังเว็บไซตทงั้ หมด เพื่ออธิบายโครงสรางทั้งหมดของเว็บไซต จัดทำใหผูใช บริการสามารถเขาถึงขอมูลที่ตองการไดรวดเร็วยิ่งขึ้น การรับฟงความคิดเห็น ขอเสนอแนะตองานบริการ ทดสอบความชำนาญ และการใชบริการผานเว็บไซต รวม ถึงความตองการจากผูใชบริการ ทำในรูปแบบสำรวจ ออนไลน (online survey) และประชาสัมพันธการ สำรวจในเมนู News & KM/ขาวสารและความรู เชน แบบสำรวจความพึงพอใจ ระบบการใหบริการ ออกแบบใหมีการลงทะเบียน แบบออนไลน (register online) เพือ่ สมัครเปนสมาชิก กอนการใชงานเว็บไซต โดยการกรอกขอมูลในแบบฟอรม อิเล็กทรอนิกส ขอมูลที่จำเปนของสมาชิกสำหรับการ ลงทะเบียน เชน ชื่อหนวยงาน ประเภทของหนวยงาน ทีอ่ ยู ชือ่ ผูป ระสานงาน และไปรษณียอ เิ ล็กทรอนิกส เพือ่ ใช ในการติดตอประสานงาน มีการใช CAPTCHA (Completely Automated Public Turing test to tell Computers and Humans Apart) ซึ่งเปนการรักษา ความปลอดภัยในการสมัครใชบริการเว็บไซต และการลง ทะเบียนตองมีการยอมรับในประกาศนโยบายรักษาขอมูล สวนบุคคลกอน เมื่อมีการลงทะเบียนแลวจะมีการตรวจ สอบขอมูลสมาชิก เพื่อพิจารณาอนุมัติการเปนสมาชิก ระบบการสมัครสมาชิก ออกแบบใหผูสมัครสามารถ กำหนดไปรษณียอ เิ ล็กทรอนิกสและรหัสผานสำหรับใชเขา สูระบบ รวมทั้งสามารถแกไขเปลี่ยนแปลงไดดวยตัวเอง เมือ่ เขาใชงานเว็บไซตระบบจะตรวจสอบและยืนยันตัวตน ผู ใ ช ง านด ว ยไปรษณี ย อิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส แ ละรหั ส ผ า น มี การแจงเตือนกรณีที่กรอกไปรษณียอิเล็กทรอนิกสหรือ รหัสผานไมถูกตอง กรณีที่ผูใชลืมรหัสผาน ระบบจะสง รหัสผานใหทางไปรษณียอิเล็กทรอนิกสที่ไดลงทะเบียน ไว กระบวนการทดสอบความชำนาญมีสว นของงานบริการ วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

71

Proficiency Testing Website and Application

Siriphorn Laomanacharoen et al.

ทีต่ อ งสือ่ สาร ติดตอรับ-สงขอมูลกับสมาชิกทุกขัน้ ตอนจน กระทัง่ ดำเนินการแลวเสร็จ และเปนกระบวนการทีเ่ กิดขึน้

เหมือนกันในทุกแผนงาน โดยขัน้ ตอนตางๆ ในงานบริการ ทดสอบความชำนาญ ดังแสดงในภาพที่ 2

ภาพที่ 2 ขั้นตอนการใหบริการทดสอบความชำนาญทางหองปฏิบัติการ สำนักยาและวัตถุเสพติด ในป ส สาวะ ด า นยาเสพติ ด ให โ ทษในของกลาง และ ดานวัตถุออกฤทธิ์ในของกลาง มี 7 ขั้นตอนเนื่องจาก ไมมีขั้นตอนการชำระเงิน) ไดแก Register/สมัครการ ทดสอบ, Payment/ชำระเงิน, Lab Code/รหัสสมาชิก, Sample Acknowledgement/ตอบรับตัวอยาง, Result Report/สงผลการทดสอบ, Interim Report/ ตอบรับรายงานฉบับราง, Final Report/รายงานฉบับ สมบูรณ และ Certificate/ใบประกาศนียบัตร

ขั้ น ตอนดั ง กล า วออกแบบให มี ลั ก ษณะเป น ผั ง ขัน้ ตอนการใหบริการ (tracking bar) และกำหนดสีของ tracking bar และหนาเว็บไซตของแตละแผนงานแตก ตางกัน สมาชิกสามารถติดตามสถานะปจจุบนั ของแผนการ ทดสอบที่ ส มั ค รได เมื่ อ ดำเนิ น การในแต ล ะขั้ น ตอน จะมีไปรษณียอิเล็กทรอนิกสตอบกลับอัตโนมัติ (auto reply E-mail) แจงยืนยันดำเนินการ แผนผังขั้นตอน การใหบริการ (tracking bar) มีกจิ กรรมรวม 8 ขัน้ ตอน ดั ง แสดงในภาพที่ 3 (ยกเว น แผนด า นสารเสพติ ด Register สมัครการทดสอบ

Register สมัครการทดสอบ

Payment ชำระเงิน

Lab Code รหัสสมาชิก

Sample Acknowledgement ตอบรับตัวอยาง

Result Report สงผลการทดสอบ

Interlm Report ตอบรับรายงานฉบับราง

Final Report รายงานฉบับสมบูรณ

Certificate ใบประกาศนียบัตร

Lab Code รหัสสมาชิก

Sample Acknowledgement ตอบรับตัวอยาง

Result Report สงผลการทดสอบ

Interlm Report ตอบรับรายงานฉบับราง

Register สมัครการทดสอบ

Lab Code รหัสสมาชิก

Sample Acknowledgement ตอบรับตัวอยาง

Result Report สงผลการทดสอบ

Interlm Report ตอบรับรายงานฉบับราง

Final Report รายงานฉบับสมบูรณ

Certificate ใบประกาศนียบัตร

Register สมัครการทดสอบ

Lab Code รหัสสมาชิก

Sample Acknowledgement ตอบรับตัวอยาง

Result Report สงผลการทดสอบ

Interlm Report ตอบรับรายงานฉบับราง

Final Report รายงานฉบับสมบูรณ

Certificate ใบประกาศนียบัตร

Final Report รายงานฉบับสมบูรณ

Certificate ใบประกาศนียบัตร

ภาพที่ 3 Tracking bar ของแผนการทดสอบความชำนาญดานยา (สีเขียว) ดานสารเสพติดในปสสาวะ (สีเหลือง) ดานยาเสพติดใหโทษในของกลาง (สีแดง) และดานวัตถุออกฤทธิ์ในของกลาง (สีน้ำเงิน)

72

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ

ขั้นตอนการใหบริการ 8 ขั้นตอน ดังตอไปดังนี้ 1. Register/สมัครการทดสอบ สมาชิกเลือก โปรแกรมที่ตองการสมัครจากรายการที่เปดใหบริการ และศึกษาขอมูลรายละเอียดของแตละโปรแกรมไดจาก คูมือการทดสอบ (PT Protocol) โดยกดปุม Protocol Download เมือ่ เลือกสมัครโปรแกรมแลวระบบจะบันทึก เปนกิจกรรมแรกตามผังขัน้ ตอนการใหบริการ (tracking bar) 2. Payment/ชำระเงิน สมาชิกแนบไฟลหลัก ฐานการชำระเงินไดทั้งในรูปแบบ PDF และ JPEG จาก นัน้ ผูจ ดั บริการทดสอบความชำนาญ ตรวจสอบและยืนยัน ความถูกตองในขั้นตอนการชำระเงิน 3. Lab Code/รหัสสมาชิก ผูจัดบริการทดสอบ ความชำนาญออกรหัสสมาชิกกอนจัดสงตัวอยางทดสอบ เพื่อใหสมาชิกใชรหัสนี้อางอิงในการตรวจสอบผลการ ประเมิน โดยเปนรหัสเฉพาะของสมาชิกแตละรายและ ออกรหัสใหมในแตละโปรแกรมการทดสอบที่สมาชิก สมัคร 4. Sample Acknowledgement/ตอบรั บ ตัวอยาง เมือ่ จัดสงตัวอยางทดสอบใหสมาชิกแลว สมาชิก ตรวจสอบสภาพตัวอยางและตอบรับตัวอยางทดสอบ โดยกรอกรายละเอียดของตัวอยาง วันที่ไดรับตัวอยาง สภาพตัวอยางทีไ่ ดรบั ในแบบฟอรมตอบรับตัวอยาง กรณี ตัวอยางที่ไดรับมีสภาพไมปกติสามารถระบุรายละเอียด สภาพตัวอยางและแนบไฟลรูปภาพประกอบได เพื่อให ผู จั ด บริ ก ารทดสอบความชำนาญพิ จ ารณาการจั ด ส ง ตัวอยางใหมใหสมาชิก 5. Result Report/ส ง ผลการทดสอบ เมื่ อ ทดสอบตัวอยางแลว สมาชิกสงผลการทดสอบโดยกรอก รายละเอียดในแบบฟอรมอิเล็กทรอนิกส ซึ่งมีรูปแบบ เฉพาะสำหรับแตละโปรแกรม ขึน้ อยูก บั ชนิดและลักษณะ ของข อ มู ล เช น ข อ มู ล ตั ว เลขและสั ญ ลั ก ษณ พิ เ ศษ ขอมูลตัวหนังสือ กรอกรายละเอียดหรือเลือกคำตอบ อย า งใดอย า งหนึ่ ง โดยข อ มู ล ที่ บั ง คั บ กรอกจะแสดง เครื่ อ งหมายดอกจั น (*) สี แ ดงกำกั บ ซึ่ ง เป น ข อ มู ล ที่ใชสำหรับการประเมินผล 6. Interim Report/ตอบรับรายงานฉบับราง เมื่อผูจัดบริการทดสอบความชำนาญจัดทำรายงานฉบับ

ศิริพร เหลามานะเจริญ และคณะ

รางเสร็จ นำขึ้นแสดงบนเว็บไซต เพื่อใหสมาชิกสามารถ เรี ย กดู แ ละบั น ทึ ก ในรู ป แบบไฟล PDF รวมทั้ ง แจ ง การแกไขหรือขอเสนอแนะตอรายงานฉบับราง 7. Final Report/รายงานฉบับสมบูรณ เมื่อ ผู จั ด บริ ก ารทดสอบความชำนาญจั ด ทำรายงานฉบั บ สมบูรณเสร็จ นำขึ้นแสดงบนเว็บไซต เพื่อใหสมาชิก สามารถเรียกดูและบันทึกในรูปแบบไฟล PDF รวมทั้ง ตอบรับรายงานฉบับสมบูรณ 8. Certificate/ใบประกาศนี ย บั ต ร สมาชิ ก ที่สงผลการทดสอบและไดรับการประเมินจะไดรับใบ ประกาศนียบัตร เพื่อแสดงถึงการเขารวมการทดสอบ ความชำนาญกั บ สำนั ก ยาและวั ต ถุ เ สพติ ด สามารถ เรี ย กดู แ ละบั น ทึ ก ในรู ป แบบไฟล PDF ได โดยใบ ประกาศนียบัตรมีทั้งฉบับภาษาไทยและภาษาอังกฤษ การใหบริการ 8 ขั้นตอนดังกลาว เมื่อสมาชิก ดำเนินการเสร็จในแตละขั้นตอน จะมีระบบสงไปรษณีย อิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส ต อบกลั บ อั ต โนมั ติ แ จ ง เพื่ อ ให ส มาชิ ก ทราบและยืนยันการดำเนินการ การนำขอมูลแสดงบน เว็บไซตและการรับขอมูลจากผูใชงานเว็บไซต มีระบบ จัดการเว็บไซตหรือระบบหลังบาน (back-office) เพื่อ บริหารจัดการ เก็บรวบรวมขอมูลและสงออก (export) ขอมูลนำมาประมวลผลผาน https://bdn.go.th/pt/ weadmin/index.php โดยกำหนดผู ที่ ส ามารถเข า ใช ง านระบบหลั ง บ า น รวมถึ ง การกำหนดสิ ท ธิ ใ นการ เขาถึงขอมูลเพื่อรักษาความปลอดภัย ซึ่งการกำหนด สิทธินี้เปนไปตามหนาที่ของผูปฏิบัติงาน ที่เกี่ยวของกับ ระบบคุณภาพผูจัดโปรแกรมการทดสอบความชำนาญ ไดแก Administrator คือ ผูจัดการคุณภาพหรือรอง ผูจัดการคุณภาพ ISO/IEC 17043 มีหนาที่ดูแลระบบ และบริ ห ารจั ด การเว็ บ ไซต ก ารทดสอบความชำนาญ หองปฏิบตั กิ ารสำนักยาและวัตถุเสพติด สามารถนำเขา ลบ และส ง ออกข อ มู ล ได Webmaster คื อ ผู ป ระสาน แผนการทดสอบความชำนาญ (coordinator) หรือ ผูท่ีไดรับมอบหมาย มีหนาที่บริหารจัดการนำเขา ลบ และสงออกขอมูลบนเว็บไซตเฉพาะในสวนทีเ่ กีย่ วของกับ แผนการทดสอบที่รับผิดชอบ และ Assistant คือ ผูรวม ดำเนินแผนการทดสอบความชำนาญ มีหนาที่เปนผูชวย webmaster สามารถเห็นและสงออกขอมูลบนเว็บไซต เฉพาะในสวนทีเ่ กีย่ วของกับแผนการทดสอบทีร่ บั ผิดชอบ วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

73

Proficiency Testing Website and Application

สำนักยาและวัตถุเสพติด ไดพัฒนาแอปพลิเคชัน การทดสอบความชำนาญ ให ส ามารถใช ไ ด กั บ ระบบ ปฏิบัติการ iOS และ Android ซึ่งสามารถดาวนโหลด ผ า นรหั ส คิ ว อาร (QR code) รู ป ภาพที่ ใ ช แ ทน แอปพลิเคชันหรือไอคอน (icon) ออกแบบโดยใชสี โทนเดียวกับเว็บไซต คือ สีเขียวและเหลือง มีตัวอักษร PT BDN สื่อความหมายชื่อภาษาอังกฤษของสำนักยา และวัตถุเสพติด และงานบริการทดสอบความชำนาญ มีภาพกราฟกที่สื่อถึงแผนภูมิแทงของ Z-Score สำหรับ ใชประเมินผลการทดสอบความชำนาญ ดังแสดงในภาพ ก)

Siriphorn Laomanacharoen et al.

ที่ 4 ก) รูปแบบการใชงานและเมนูแอปพลิเคชันมีลกั ษณะ เดียวกับเว็บไซต สมาชิกสามารถเขาสูขั้นตอนการดำเนิน งานผานแอปพลิเคชันไดเชนเดียวกันกับผานเว็บไซต โดย แอปพลิเคชันมีระบบการใชงานที่มากกวาเว็บไซต คือ การแจงเตือน (notification) สามารถสงขอความสั้นๆ สำหรับแจงเตือนสมาชิกในเรื่องตางๆ ที่เกี่ยวกับการ ดำเนินงานทดสอบความชำนาญ โดยแสดงบนหนาจอ ของโทรศั พ ท เ คลื่ อ นที่ แ บบสมาร ต โฟนหรื อ แท็ บ เล็ ต ดังแสดงในภาพที่ 4 ข) ข)

ภาพที่ 4 ก) แอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญ สำนักยาและวัตถุเสพติด และ ข) ตัวอยาง ขอความแจงเตือนแสดงบนหนาจอของโทรศัพทเคลื่อนที่แบบสมารตโฟน เมื่ อ เว็ บ ไซต มี ค วามพร อ มเป ด ใช ง าน จึ ง เริ่ ม ประชาสั ม พั น ธ แ ละแนะนำการใช ง านในการประชุ ม สั ม มนาสมาชิ ก แผนการทดสอบความชำนาญประจำ ปงบประมาณ พ.ศ. 2560 ของแตละแผนงานในชวง พฤศจิกายน พ.ศ. 2559 ถึง กุมภาพันธ พ.ศ. 2560 สวนแอปพลิเคชันเปดใชงาน โดยเริ่มประชาสัมพันธและ แนะนำการใชงานในการประชุมสัมมนาสมาชิกแผนการ ทดสอบความชำนาญประจำปงบประมาณ พ.ศ. 2561 ของ แตละแผนงานเมือ่ วันที่ 19-20 ธันวาคม พ.ศ. 2560 และ ประชาสัมพันธใหสมาชิกทราบผานทางหนังสือราชการ และไปรษณียอิเล็กทรอนิกส ตัง้ แตเริม่ เปดการใชงานถึงป พ.ศ. 2563 มีจำนวน หองปฏิบัติการสมัครเปนสมาชิกเขาใชเว็บไซตประมาณ

74

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

1,300 ราย และแอปพลิเคชันประมาณ 370 ราย มีการ สำรวจความพึงพอใจการใหบริการทดสอบความชำนาญ ผานทางเว็บไซตและแอปพลิเคชันเปนประจำทุกป โดย มีสมาชิกที่สมัครเขารวมการทดสอบความชำนาญเฉลี่ย ปละ 878 ราย ตอบแบบสอบถามความพึงพอใจเฉลี่ย ปละ 235 ราย อัตราการตอบกลับแบบสอบถามเฉลี่ย ร อ ยละ 27 รู ป แบบของแบบสอบถามเป น การเลื อ ก ระดับความพึงพอใจ 5 ระดับ ป พ.ศ. 2560 ซึ่งเปดใช เว็บไซตเปนครั้งแรก สำรวจความพึงพอใจในประเด็น รูปแบบของเว็บไซต เพือ่ นำผลสำรวจมาพิจารณาปรับปรุง โดยเป น การสำรวจรู ป แบบด า นความเหมาะสมของ การออกแบบ ความถูกตองของขอมูลและเนื้อหา การเขา ถึงเว็บไซตและระบบรักษาความปลอดภัย ความเหมาะสม

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ

ของเมนูคำสั่ง และความสะดวกในการใชงานแตละลำดับ ขัน้ ตอน พบวาคะแนนความพึงพอใจรูปแบบของเว็บไซต ในแตละดานคิดเปนรอยละ 87.5, 86.8, 86.9, 84.7 และ 85.4 ตามลำดับ ในป พ.ศ. 2560-2563 พบวาเมื่อ สำรวจความพึงพอใจของสมาชิกตอเว็บไซตในประเด็น การมีขอมูลและเนื้อหาที่เขาใจงาย ครบถวน และทันสมัย

ศิริพร เหลามานะเจริญ และคณะ

ดังแสดงในตารางที่ 1 เมื่อเปรียบเทียบความพึงพอใจ เว็บไซตในแตละป โดยใชสถิติไคสแควร (χ2-test) พบ วา χ2 มีคาเทากับ 20.181, degree of freedom เทากับ 12 ดังนั้นในแตละป (พ.ศ. 2560-2563) สมาชิกมีความ พึงพอใจตอเว็บไซตไมแตกตางกัน (p > 0.05)

ตารางที่ 1 ผลการสำรวจความพึงพอใจของสมาชิกแผนการทดสอบความชำนาญของสำนักยาและวัตถุเสพติดตอ เว็บไซต ระหวาง ป พ.ศ. 2560-2563 ป พ.ศ. 2560 2561 2562 2563

พอใจมาก 66 155 98 115

ผลความพึงพอใจเว็บไซต พอใจ ปานกลาง ไมพอใจ 73 8 0 142 41 3 90 11 1 122 12 2

ผลการสำรวจความพึงพอใจในภาพรวมของการให บริ ก ารทดสอบความชำนาญ ผ า นทางเว็ บ ไซต แ ละ แอปพลิเคชัน ประจำปงบประมาณ พ.ศ. 2560-2563 พบวาสมาชิกมีความพึงพอใจมากที่สุด คือ การมีระบบ ความปลอดภัยดวยการใชรหัสผาน และสมาชิกมีความพึง พอใจนอยทีส่ ดุ คือ ความยุง ยากของขัน้ ตอนการชำระเงิน และความซับซอนของแบบฟอรมการสงผลการทดสอบ เมื่ อ นำข อ มู ล การดำเนิ น งานจั ด โปรแกรมการ ทดสอบความชำนาญระหว า งป พ.ศ. 2560-2563 มาประเมิ น ความคุ ม ค า ของการใช เ ว็ บ ไซต แ ละ

ไมพอใจมาก 1 2 0 0

รวม

คะแนน รอยละ

148 343 200 251

87.4 86.0 88.5 87.9

แอปพลิ เ คชั น โดยคำนวณค า เฉลี่ ย ต อ ป ข องค า จั ด ทำ เอกสารและค า ขนส ง ทางไปรษณี ย ปริ ม าณการใช กระดาษ และระยะเวลาที่ใชในการจัดการเอกสารสำหรับ สงไปรษณีย (คิดระยะเวลาการจัดและตรวจสอบความ ถูกตองของเอกสารตอสมาชิก 1 รายเทากับ 30 วินาที) เปรี ย บเที ย บระหว า งการใช แ ละไม ใ ช เ ว็ บ ไซต ใ นการ ดำเนิ น งาน (ไม ร วมขั้ น ตอนการจั ด ส ง ตั ว อย า ง ทดสอบ) โดยใช ส ถิ ติ paired sample t-test ดังแสดงในตารางที่ 2 พบวามีความแตกตางกันอยางมี นัยสำคัญทางสถิติ (p < 0.05)

ตารางที่ 2 ความแตกตางของคาจัดทำเอกสารและคาขนสงทางไปรษณีย ปริมาณการใชกระดาษ และระยะเวลาทีใ่ ชใน การจัดการเอกสารสำหรับสงไปรษณีย ระหวางการใชและไมใชเว็บไซตในการดำเนินงานระหวางป พ.ศ. 2560-2563 รายการ คาเฉลี่ยจัดทำเอกสารและคาขนสง ทางไปรษณีย (บาท) ปริมาณเฉลี่ยการใชกระดาษ (แผน) ระยะเวลาเฉลี่ยที่ใชจัดการเอกสาร (นาที)

ใชเว็บไซต 45,900

ไมใชเว็บไซต 268,562

ประหยัดได (รอยละ) 222,662 (82.9)

t-value 17.066*

1,080 540

213,294 1,589

212,214 (99.5) 1,049 (66.0)

12.862* 23.541*

*p < 0.05 วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

75

Proficiency Testing Website and Application

เมือ่ ปดใชงานเว็บไซตแลวมีการบำรุงรักษา ปรับปรุง และพั ฒ นาเป น ประจำทุ ก ป เช น ป 2561 การเพิ่ ม ความปลอดภั ย ของเว็ บ ไซต เนื่ อ งจากมี ข อ มู ล ส ว น ตั ว และข อ มู ล การชำระเงิ น ของสมาชิ ก ในฐานข อ มู ล รวมทั้ ง การทดสอบความชำนาญเป น การประเมิ น ความสามารถของสมาชิ ก ซึ่ ง การรั ก ษาความลั บ เป น ข อ ก ำ ห น ด ที่ ส ำ คั ญ ต า ม ม า ต ร ฐ า น I S O / I E C 17043:2010 ผูจัดบริการแผนการทดสอบความชำนาญ ต อ งดำเนิ น การตามข อ กำหนด จึ ง เปลี่ ย นจากการใช http (Hypertext Transport Protocol) เปน https (Hypertext Transfer Protocol over Secure Socket Layer หรือ http over SSL) เพื่อปองกันการเขาถึง ขอมูลจากผูอ นื่ การปรับรูปแบบของแบบฟอรมการสงผล การทดสอบ เนือ่ งจากบางโปรแกรมการทดสอบมีตวั อยาง ทดสอบมากกวา 1 ตัวอยาง การจัดเรียงแบบฟอรมจึงมี ลักษณะเรียงตอกันเปนแนวยาว ตองใชแถบเลือ่ นจอภาพ เพื่อกรอกขอมูลใหครบทุกตัวอยาง ซึ่งมีความยุงยากใน การกรอกขอมูลและมีโอกาสผิดพลาด ดังนัน้ จึงออกแบบ ใหมลี กั ษณะเปนแบบฟอรมของแตละตัวอยางแยกกันและ วางซอนทับกัน โดยมีแถบคัน่ แสดงชือ่ ตัวอยางสำหรับคลิก เพื่อเลือกแสดงหนาแบบฟอรมของตัวอยางนั้นๆ เปน การลดระยะการเลื่อนจอภาพใหสั้นลง การใชหนาตาง แบบผุดขึ้น (pop-up window) แสดงทางเขาแบบ สำรวจความพึงพอใจซอนทับทีห่ นาแรกของเว็บไซต เพือ่ เชิญชวนใหสมาชิกมีสวนรวมในการตอบแบบสอบถาม ซึง่ เปนชองทางทีส่ ะดวกและเขาถึงไดงา ย ในป 2562 มีการ เปลี่ยนภาพประกอบที่หนาแรกของเว็บไซต เนื่องจากใน ชวงแรกของการจัดทำเว็บไซตใชภาพประกอบจากเว็บไซต รูปภาพที่ไมมีลิขสิทธิ์และไมเสียคาใชจาย เมื่อเปดใชงาน เว็บไซตไดระยะหนึ่ง จึงมีการเปลี่ยนเปนภาพประกอบ แบบเคลื่ อ นไหว ที่ สื่ อ ถึ ง กิ จ กรรมทางห อ งปฏิ บั ติ ก าร ของสมาชิก โดยเปนภาพที่ถายจากหองปฏิบัติการของ สำนั ก ยาและวั ต ถุ เ สพติ ด เพื่ อ ให เ ว็ บ ไซต น า สนใจ มี เอกลักษณและทันสมัย ในป 2563 เพิ่มความถี่ในการ สำรองขอมูล (backup data) เนื่องจากการเพิ่มจำนวน แผนการทดสอบที่เปดใหบริก ารและจำนวนสมาชิกที่ เพิ่มขึ้น ปริมาณขอมูลที่จัดเก็บในฐานขอมูลมีเพิ่มขึ้น จึง

76

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siriphorn Laomanacharoen et al.

ปรับความถี่ในการสำรองขอมูลจากทุก 3 วัน เปนทุกวัน เพื่ อ ป อ งกั น ความเสี่ ย งจากการสู ญ หายและการถู ก โจรกรรมขอมูล การปรับรูปแบบของ tracking bar เนือ่ งจากในแตละแผนงานเมือ่ เปดใหบริการจำนวนหลาย โปรแกรมทดสอบพรอมกัน จะมีกำหนดชวงเวลา (timeline) แตละขั้นตอนของกิจกรรมที่ทับซอนกัน สมาชิกที่ สมัครหลายโปรแกรมทดสอบอาจไมสามารถจดจำขัน้ ตอน ได จึงใชความเขมของสี tracking bar ชวยแสดงสถานะ ปจจุบัน โดยสีเขม 100% แสดงถึงขั้นตอนของกิจกรรม ที่ดำเนินการเสร็จเรียบรอย สีเขม 50% แสดงถึงขั้นตอน ของกิจกรรมที่สามารถดำเนินการได แตสมาชิกยังไมได ดำเนินการ และสีขาวแสดงถึงขั้นตอนของกิจกรรมที่ยัง ไมสามารถดำเนินการได

วิจารณ การจั ด บริ ก ารทดสอบความชำนาญของสำนั ก ยาและวั ต ถุ เ สพติ ด เป น การดำเนิ น งานที่ มี ร ะบบงาน หลายขั้นตอนที่เหมือนกันในทุกแผนงาน สวนใหญเปน การติดตอสื่อสารกับสมาชิก ดังนั้นหากมีวิธีจัดการที่ดี จะสามารถออกแบบเว็บไซตใหมีลักษณะที่ใชไดกับทุก แผนงาน สมาชิกสามารถเขาใจขั้นตอนการดำเนินงาน ติดตามสถานะ และไมพลาดขั้นตอนการเขารวมการ ทดสอบ เนื่องจากแผนงานเปดใหบริการเพียงปละหนึ่ง ครั้ง สมาชิกจึงอาจจำขั้นตอนไมได รูปแบบเว็บไซตจึง ออกแบบใหมสี เี ฉพาะของแตละแผนงานและมีผงั ขัน้ ตอน การใหบริการ (tracking bar) แสดงสถานะปจจุบัน สมาชิกสามารถเขาถึงขอมูล เอกสาร และแบบฟอรมตางๆ ผานทางเว็บไซตและแอปพลิเคชันไดตลอดเวลา ทำใหลด การจัดสงเอกสารในรูปแบบกระดาษ จึงไมมีปญหาการ สูญหายของเอกสารและไมมกี ารจัดสงเอกสารซ้ำ ลดภาระ งานในการแกไขปญหาเอกสารสูญหายได เชน การแจง รหัสสมาชิก ซึ่งใชสำหรับการตรวจสอบผลการทดสอบ ในรายงาน กอนการดำเนินงานดวยระบบเว็บไซตไดรับ การรองขอจากสมาชิกใหจัดสงเอกสารแจงรหัสสมาชิก อีกครั้งเนื่องจากการสูญหาย เมื่อมีการใชเว็บไซตสมาชิก สามารถเขาถึงขอมูลดวยตนเอง การสงผลทดสอบเปน ขั้นตอนที่มีความสำคัญ เนื่องจากเปนการนำขอมูลจาก สมาชิกมาประเมินผล กอนการดำเนินงานดวยระบบ

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ

เว็บไซต สมาชิกตองกรอกผลการทดสอบในแบบฟอรม ตามรูปแบบกระดาษที่จัดสงให และสงกลับมาที่สำนัก ยาและวัตถุเสพติดทางไปรษณียหรือโทรสาร พบวาเกิด ปญหาความยุงยาก การบริหารจัดการแบบฟอรมที่ไดรับ จากสมาชิก ตองตรวจสอบความถูกตองของเอกสารกอน นำขอมูลไปประเมินผลและตองมีวิธีจัดการเก็บเอกสาร เพื่อรักษาความลับตามขอกำหนดของมาตรฐาน ISO/ IEC 17043:2010 นอกจากนี้การนำขอมูลจากสมาชิก มาประเมินผลตองมีขนั้ ตอนการถายโอนขอมูล โดยนำมา พิมพจากแบบฟอรมกระดาษบันทึกเปนไฟลคอมพิวเตอร เพื่อคำนวณผลทางสถิติ จึงมีโอกาสเกิดความผิดพลาด สงผลใหการประเมินไมถูกตองและกระทบภาพลักษณ ความนาเชื่อถือของหนวยงาน เมื่อดำเนินงานดวยระบบ เว็บไซตจะสงออกขอมูลจากระบบจัดการเว็บไซตเปนรูป แบบไฟลและนำไปคำนวณไดโดยตรง ทำใหขอ มูลมีความ ถูกตอง งายตอการบริหารจัดการ การจัดเก็บ และการ สืบคนขอมูล นอกจากนี้ไดออกแบบเว็บไซตใหมีระบบ ลงทะเบียนสำหรับการจัดอบรมสัมนาใหแกสมาชิก รวม ถึงการประชาสัมพันธแจงขาวสารที่เกี่ยวของ ซึ่งสามารถ ใหบริการแบบเบ็ดเสร็จภายในเว็บไซต จากการดำเนิ น งานด ว ยระบบเว็ บ ไซต แ ละ แอปพลิเคชันชวงระหวางป พ.ศ. 2560-2563 ไดมีการ สำรวจความพึงพอใจของสมาชิกทุกป เพื่อรับฟงปญหา ขอคิดเห็นและขอเสนอแนะ นำมาปรับปรุงพัฒนางาน ในป พ.ศ. 2560 เปดการใชงานเว็บไซตพบวามีจำนวน ผูต อบแบบสำรวจจำนวนนอย เนือ่ งจากแบบสำรวจแสดง อยูใ นเมนู “News & KM/ขาวสารและความรู” อาจทำให การเขาถึงแบบสำรวจไมสะดวก ในปถัดมาจึงปรับปรุง โดยการใชหนาตางแบบผุดขึ้น เพื่อประชาสัมพันธการ สำรวจความพึงพอใจ สิ่งที่สมาชิกมีความพึงพอใจมาก ที่สุด คือ การมีระบบความปลอดภัยดวยการใชรหัสผาน เนื่ อ งจากเว็ บ ไซต แ ละแอปพลิ เ คชั น เป น เครื่ อ งมื อ ที่ เหมาะสม สามารถนำขอดีของเทคโนโลยีสารสนเทศ เรือ่ ง การรั ก ษาความปลอดภัยในการเขาถึงขอ มูลดวยรหัส ผานมาชวยในการดำเนินงาน สามารถสรางความมั่นใจ ใหกับสมาชิกวาไมมีการรั่วไหลของขอมูลไปบุคคลอื่นได ประเด็นที่สมาชิกมีความพึงพอใจนอยที่สุด คือ ความ ยุงยากของขั้นตอนการชำระเงินและความซับซอนของ แบบฟอรมสงผลการทดสอบ เนื่องจากขั้นตอนการชำระ

ศิริพร เหลามานะเจริญ และคณะ

เงินเปนการแนบไฟลหลักฐานการชำระเงิน ภายหลัง จากสมาชิกดำเนินการชำระเงินที่ธนาคารแลว เพื่อนำมา ตรวจสอบและดำเนินการตามระเบียบของราชการ ทั้งนี้ ไดมกี ารชีแ้ จงและสรางความเขาใจกับสมาชิก ถึงขอจำกัด ของการปรับเปลีย่ นวิธกี ารชำระเงินในการประชุมสัมมนา สมาชิกแผนการทดสอบความชำนาญประจำป สวนความ ซับซอนของแบบฟอรมสงผลการทดสอบนั้น ไดมีการ ปรับปรุง แกไขแบบฟอรมใหเหมาะสมอยางตอเนื่อง เนือ่ งจากแตละโปรแกรมการทดสอบมีขอ มูลรายละเอียด ที่ ส มาชิ ก ต อ งกรอกแตกต า งกั น ไป โดยการออกแบบ แบบฟอรมสงผลการทดสอบไดคำนึงถึงรูปแบบการก รอก ซึ่งไมทำใหสมาชิกเกิดความสับสนและเขาใจงาย แตตองไดขอมูลจากสมาชิกที่ครบถวน ชัดเจน เพื่อนำมา ประเมินผลการทดสอบของสมาชิกไดอยางถูกตองและมี ประสิทธิภาพ การดำเนิ น งานและการสื่ อ สารกั บ สมาชิ ก ใน ขั้นตอนตางๆ ผานระบบของเว็บไซต สามารถลดปริมาณ การใชกระดาษ ลดคาใชจายในการจัดทำเอกสารและ คาจัดสงทางไปรษณียไดอยางมาก รวมทั้งลดระยะเวลา ที่ ใ ช ใ นการจั ด การ ภายหลั ง การเริ่ ม ใช เ ว็ บ ไซต ตั้ ง แต พ.ศ. 2560-2563 มีการปรับปรุงพัฒนาเว็บไซตและมี การขยายงานบริการทดสอบความชำนาญอยางตอเนื่อง เชน เปดโปรแกรมการทดสอบใหม เพิ่มรายการทดสอบ ตามที่ไดรับการรับรองความสามารถการเปนผูจัดการ ทดสอบความชำนาญ การคิ ด จุ ด คุ ม ทุ น ระหว า งการ ประหยัดคาใชจายเปรียบเทียบกับคาจางพัฒนา และ คาดูแลรักษาเว็บไซตไมสามารถทำไดอยางชัดเจน การจัด บริ ก ารทดสอบความชำนาญสามารถสร า งรายได จากการเขารวมทดสอบของสมาชิก ซึ่งมีมูลคาที่สามารถ รองรับคาจางพัฒนาและคาดูแลรักษาเว็บไซตได เมื่อ เว็ บ ไซต ส ามารถให ก ารบริ ก ารทดสอบความชำนาญ ที่ดี มีความนาเชื่อถือ และสรางความพึงพอใจใหกับ สมาชิ ก นอกจากจะสามารถรั ก ษาฐานจำนวนสมาชิ ก ที่ใชบริการเขารวมทดสอบใหคงไวไดแลว ยังสามารถ เพิ่มสมาชิกรายใหมไดในแตละป การประหยัดคาใชจาย และรายไดทสี่ รางขึน้ จะมีมลู คาทีม่ ากกวาคาใชจา ยในการ ดูแลรักษาเว็บไซต ดังนัน้ การใชเว็บไซตในการดำเนินงาน จัดบริการทดสอบความชำนาญจึงมีความคุมคา วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

77

Proficiency Testing Website and Application

นอกจากมี ก ารนำระบบเว็ บ ไซต ม าใช ใ นการ ดำเนินงานแลว แอปพลิเคชันไดรับการพัฒนาขึ้นเพื่อใช ควบคูไ ปกับเว็บไซต สามารถใชงานในการใหบริการทัง้ 8 ขั้นตอนไดเชนเดียวกับเว็บไซต เนื่องจากประโยชนจาก แอปพลิเคชันที่สามารถทำใหสมาชิกเขาถึงขั้นตอนการ ดำเนินงานทดสอบความชำนาญไดงายไดทุกเวลา ผาน โทรศัพทเคลื่อนที่ นอกจากนี้ระบบการแจงเตือนผาน แอปพลิเคชันมีประโยชนชวยใหสมาชิกไมพลาดในการ ดำเนินงานแตละขั้นตอนของการทดสอบซึ่งมีกำหนด ระยะเวลาในการดำเนิ น งาน แต แ อปพลิ เ คชั น ก็ มี ข อ จำกัดในบางขั้นตอนเชนการกรอกผลการทดสอบผาน แอปพลิเคชันบนโทรศัพทเคลื่อนที่ ซึ่งขอมูลที่สมาชิก ตองกรอกในบางโปรแกรมทดสอบนั้นมีจำนวนมาก และ ขนาดของการแสดงภาพบนหนาจอโทรศัพทเคลื่อนที่นั้น มีจำกัด ทำใหการกรอกผลการทดสอบทางคอมพิวเตอร ผานเว็บไซตจึงสะดวกกวาการใชแอปพลิเคชัน การนำประโยชน ข องเทคโนโลยี ส ารสนเทศมา พัฒนางานบริการจัดการทดสอบความชำนาญโดยการจัด ทำเว็บไซตและแอปพลิเคชันนั้น สามารถเปลี่ยนรูปแบบ การดำเนินงานใหทนั สมัยและรวดเร็ว สามารถลดคาใชจา ย ลดระยะเวลาในการดำเนินงานไดอยางมาก ผูจัดการ ทดสอบความชำนาญต อ งมี ก ารตรวจสอบและทวน สอบความถูกตองของการดำเนินงานผานเว็บไซตและ แอปพลิ เ คชั น ความถู ก ต อ งของข อ มู ล มี ก ารจั ด เก็ บ และการรั ก ษาความปลอดภั ย ของข อ มู ล ด ว ย เพื่ อ ใหการดำเนินงานเปนผูจัดบริการทดสอบความชำนาญ สอดคล อ งกั บ ระบบคุ ณ ภาพมาตรฐาน ISO/IEC 17043:2010 เพิ่มประสิทธิภาพในการดำเนินงานและ สรางความเชื่อมั่นใหกับสมาชิกในการเขารวมทดสอบ ความชำนาญกับสำนักยาและวัตถุเสพติด

สรุป สำนักยาและวัตถุเสพติดไดพัฒนาการดำเนินงาน ทดสอบความชำนาญทางห อ งปฏิ บั ติ ก าร โดยจั ด ทำ เว็ บ ไซต แ ละแอปพลิ เ คชั น การทดสอบความชำนาญ หองปฏิบัติการ เริ่มใชงานเมื่อ พ.ศ. 2560 และ 2561 ตามลำดับ เปดใหบริการทดสอบความชำนาญ จำนวน 4 แผนงาน คื อ ด า นยา ด า นสารเสพติ ด ในป ส สาวะ

78

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

Siriphorn Laomanacharoen et al.

ดานยาเสพติดใหโทษในของกลางและดานวัตถุออกฤทธิ์ ในของกลางมีสมาชิกประมาณ 1,300 แหง เว็บไซต และแอปพลิ เ คชั น ที่ พั ฒ นาขึ้ น สามารถช ว ยให ก าร ดำเนิ น งานสะดวกและรวดเร็ ว ขึ้ น ลดขั้ น ตอน การดำเนิ น งาน เมื่ อ เปรี ย บเที ย บค า จั ด ทำเอกสาร และค า ขนส ง ทางไปรษณี ย ปริ ม าณการใช ก ระดาษ และระยะเวลาที่ ใ ช ใ นการจั ด การเอกสารสำหรั บ ส ง ไปรษณีย ระหวางการใชและไมใชเว็บไซตในการดำเนิน งานดวยสถิติ paired sample t-test พบวามีความ แตกตางกันอยางมีนัยสำคัญทางสถิติ (p < 0.05) โดย ลดคาใชจา ยไดรอ ยละ 82.9 ลดปริมาณการใชกระดาษได รอยละ 99.5 และลดระยะเวลาการดำเนินงานไดรอยละ 66.0 เมื่ อ เปรี ย บเที ย บความพึ ง พอใจของสมาชิ ก ต อ เว็ บ ไซต ใ นแต ล ะป (พ.ศ. 2560-2563) ประเด็ น การมีขอมูลและเนื้อหาที่เขาใจงาย ครบถวน และทันสมัย โดยใชสถิติไคสแควร พบวาสมาชิกมีความพึงพอใจตอ เว็บไซตไมแตกตางกัน (p > 0.05) นอกจากนี้สามารถ สรางภาพลักษณการทำงานที่ดีใหกับสำนักยาและวัตถุ เสพติดในฐานะการเปนผูจัดการทดสอบความชำนาญ ทางหองปฏิบัติการ สงเสริมการดำเนินงานที่เปนมิตร ต อ สิ่ ง แวดล อ มและมี ค วามปลอดภั ย ในสถานการณ การแพรระบาดของโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 ดวย การลดการสัมผัส ความทันสมัยดวยการใชเทคโนโลยี สารสนเทศ สอดคลองกับนโยบายไทยแลนด 4.0

กิตติกรรมประกาศ ขอขอบคุณ นางสาวสุรัชนี เศวตศิลา ผูอำนวยการ สำนักยาและวัตถุเสพติด ทีใ่ หการสนับสนุนในการดำเนิน งาน นางอรพิณ ทนันขัติ และ นางสาวพัชรินทร เนื่องสาร ทีใ่ หคำแนะนำ ทำใหการพัฒนาเว็บไซตและแอปพลิเคชัน การทดสอบความชำนาญสำนักยาและวัตถุเสพติด สำเร็จ ลุลวงไปดวยดี

เอกสารอางอิง 1. ISO/IEC 17025:2005. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization; 2005.

เว็บไซตและแอปพลิเคชันการทดสอบความชำนาญหองปฏิบัติการ 2. ISO/IEC 17043:2010. Conformity assessment -- General requirements for proficiency testing. Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization; 2010. 3. Thompson M, Ellison SL, Wood R. The International Harmonized Protocol for the proficiency testing of analytical chemistry laboratories. Pure Appl Chem 2006; 78(1): 145-96. 4. EDQM Council of Europe. Physico-chemical and biological PTS. [online]. 2021; [cited 2021 Apr 11]; [2 screens]. Available from: URL: https://www.edqm.eu/en/physico-chemicaland-biological-pts. 5. UNODC. Quality assurance support International Quality Assurance Programme (IQAP). [online]. 2022; [1 screen]. Available from: URL: https://www.unodc.org/LSS/Home/ICE.

ศิริพร เหลามานะเจริญ และคณะ 6. สํ า นั ก งานรั ฐ บาลอิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส ( องค ก รมหาชน). มาตรฐานเว็บไซตภาครัฐ (Government Website Standard). [ออนไลน]. 2559; [สืบคน 11 เมษายน 2564]; [83 หนา]. เขาถึงไดที่: URL: https://www. dga.or.th/wp-content/uploads/2016/05/ file_a7306e9cc94a76f649511fa3a9bcbac9.pdf. 7. สํ า นั ก งานรั ฐ บาลอิ เ ล็ ก ทรอนิ ก ส (องค ก รมหาชน). มาตรฐานเว็บไซตภาครัฐ เวอรชัน 2.0 (Government Website Standard Version 2.0). [ออนไลน]. 2560; [สืบคน 11 เมษายน 2564]; [113 หนา]. เขาถึงไดที่: URL: http://www.oic.go.th/FILEWEB/CABINFOCENTER6/DRAWER020/GENERAL/ DATA0001/00001722.PDF.

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

79

Proficiency Testing Website and Application

Siriphorn Laomanacharoen et al.

Proficiency Testing Website and Application of the Bureau of Drug and Narcotic Siriphorn Laomanacharoen, Masvalai Likitthanasrate, and Angkana Kritpitakngoen Bureau of Drug and Narcotic, Department of Medical Sciences, Nonthaburi 11000, Thailand

ABSTRACT The Bureau of Drug and Narcotic provides proficiency testing (PT) for pharmaceutical and

narcotic analysis programs. The objective of this study was to evaluate competency of drug and narcotic testing laboratories for use as evidence to indicate the reliability of testing results. Initially, the bureau coordinated with drug and narcotic laboratories by sending formal letters via post and facsimile. It was found that there were problems of document loss, high cost of document preparation and distribution, difficulties with management, and storage of paper documents. In 2017-2018, website and application programs were implemented, respectively, to develop the document management for PT operations. Based on the website and application in PT operation during 2017–2020, the difference of cost of document preparation and distribution, paper and time consumption for document management between the use and non-use periods of the website was found to be statistically significant (paired sample t-test, p < 0.05). The difference of website satisfaction in each year (during 2017–2020) was not significant. The most satisfaction was noted for security system by using password. The proficiency testing website and application programs have been found to promote convenient and rapid operations and reduce the operating cost. In addition, it can enhance contactless operations with environmental friendliness and safety during the COVID-19 pandemic, promote good image and modernize the operation by using information technology in accordance with the Thailand 4.0 policy. Keywords: Proficiency testing, Website, Application, Bureau of Drug and Narcotic

80

วารสารกรมวิทยาศาสตรการแพทย ปที่ 64 ฉบับที่ 1 มกราคม - มีนาคม 2565

วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

THE BULLETIN OF THE DEPARTMENT OF MEDICAL SCIENCES

วารสารกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ จััดทำโดยกรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กระทรวงสาธารณสุุข เพื่่�อเผยแพร่่ผลงาน วิิชาการด้้านวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ทุุกสาขา

The Bulletin of the Department of Medical Sciences is an official publication of the Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health. It is devoted to the dissemination of knowledge concerning medical sciences and the facilitation of co-operation among scientists.

เจ้้าของ

กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กระทรวงสาธารณสุุข

Owner

Department of Medical Sciences, Ministry of Public Health

ที่่�ปรึึกษาด้้านบริิหาร

นพ.ศุุภกิิจ ศิิริิลัักษณ์์ นพ.บััลลัังก์์ อุุปพงษ์์

นพ.พิิเชฐ บััญญััติิ นพ.ปิิยะ ศิิริิลัักษณ์์

Administrative Advisor

Supakit Sirilak Ballang Uppapong

Phichet Banyati Piya Sirilak

ที่่�ปรึึกษาด้้านวิิชาการ

นางพิิมพ์์ใจ นััยโกวิิท ดร.ปนััดดา ซิิลวา ดร.บุุษราวรรณ ศรีีวรรธนะ

ดร.สุุมล ปวิิตรานนท์์ ดร.เดืือนถนอม พรหมขััติิแก้้ว

Technical Advisor

Pimjai Naigowit Panadda Silva Busarawan Sriwanthana

Sumol Pavitranon Duanthanorm Promkhatkaew

บรรณาธิิการบริิหาร

ดร.ประไพ วงศ์์สิินคงมั่่�น

Executive Editor

Prapai Wongsinkongman

บรรณาธิิการ

ดร.อภิิวััฎ ธวััชสิิน

Editor

Apiwat Tawatsin

รองบรรณาธิิการ

นางสิิริิภากร แสงกิิจพร ดร.นวลจัันทร์์ วิิจัักษณ์์จิินดา

ดร.อุุรุุญากร จัันทร์์แสง

Assistant Editor

Siripakorn Sangkitporn Nuanjan Wichukchinda

Uruyakorn Chansang

คณะบรรณาธิิการ

ศ.เกีียรติิคุุณ ดร.พิิไลพัันธ์์ พุุธวััฒนะ ศ.ดร.นพ.ประเสริิฐ เอื้้�อวรากุุล ดร.ดนััย ทิิวาเวช ภญ.สุุวรรณา จารุุนุุช ศ.ดร.นพ.เผด็็จ สิิริิยะเสถีียร ศ.ดร.พรพิิมล กองทิิพย์์ รศ.ดร.ศรีีสุุรางค์์ ตัันติิมาวานิิช ดร.สุุณีี ศิิริิวิิชยกุุล รศ.ดร.ภญ.ชนิิตรา ธุุวจิิตต์์ รศ.ดร.ภญ.พิิณทิิพย์์ พงษ์์เพชร ดร.สลัักจิิต ชุุติิพงษ์์วิิเวท ดร.อุุษาวดีี ถาวระ นายสุุธน วงษ์์ชีีรีี นางวิิชชุุดา จริิยะพัันธุ์์� ดร.สุุภาณีี ดวงธีีรปรีีชา รศ.ดร.นวลฉวีี เวชประสิิทธิ์์� ดร.วัันทนา ปวีีณกิิตติิพร ดร.ปิิยะดา หวัังรุ่่�งทรััพย์์

มหาวิิทยาลััยมหิิดล มหาวิิทยาลััยมหิิดล มหาวิิทยาลััยนเรศวร มหาวิิทยาลััยหััวเฉีียวเฉลิิมพระเกีียรติิ จุุฬาลงกรณ์์มหาวิิทยาลััย มหาวิิทยาลััยมหิิดล มหาวิิทยาลััยมหิิดล จุุฬาลงกรณ์์มหาวิิทยาลััย มหาวิิทยาลััยมหิิดล นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ นัักวิิชาการอิิสระ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

Editorial Board

Pilaipan Puthavathana Prasert Auewarakul Danai Tiwawech Suwanna Charunut Padet Siriyasatien Pornpimol Kongtip Srisurang Tantimavanich Sunee Sirivichayakul Chanitra Thuwajit Pintip Pongpech Salakchit Chutipongvivate Usavadee Thavara Suthon Vongsheree Wichuda Jariyapan Supanee Duangteraprecha Nuanchawee Wetprasit Wantana Paveenkittiporn Piyada Wangroongsarb

Mahidol University Mahidol University Naresuan University Huachiew Chalermprakiet University Chulalongkorn University Mahidol University Mahidol University Chulalongkorn University Mahidol University Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Independent Scholar Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences

ฝ่่ายจััดการ

นางสาวน้้ำฝน น้้อยประเสริิฐ นางสาวประสาน จุุลวงษ์์ นางสาวอภิิมน จิิรพงศธร นายนาวีี ศรีีวรมย์์ นางสาวภาวิิณีี สุุขเจริิญ

กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์

Administration

Numfon Noiprasert Prasan Julwong Aphimon Jiraphongsathorn Navy Srivarom Pawinee Sukcharoen

Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences Department of Medical Sciences

สำนัักงานวารสาร

กรมวิิทยาศาสตร์์การแพทย์์ 88/7 ซอยติิวานนท์์ 14 ถนนติิวานนท์์ นนทบุุรีี 11000 โทร. 0-2951-0000  โทรสาร 0-2951-1297

Office

Department of Medical Sciences 88/7 Soi Tiwanond 14, Tiwanond  Rd., Nonthaburi 11000, Thailand. Tel. 0-2951-0000  Fax: 0-2951-1297

พิิมพ์์ที่่�

บริิษััท ธนอรุุณการพิิมพ์์ จำกััด 457/6-7 ถนนพระสุุเมรุุ แขวงบวรนิิเวศ เขตพระนคร กรุุงเทพฯ 10200 โทร. 0-2282-6033-4

Printed by

Thanaaroonkarnpim Co., Ltd. 457/6-7 Phra Sumen Road, Bangkok 10200 Tel. 0-2282-6033-4

วารสาร วารสาร

กรมวิ กรมวิททยาศาสตร์ ยาศาสตร์กการแพทย์ ารแพทย์ BULLETIN BULLETINOF OFTHE THEDEPARTMENT DEPARTMENTOF OFMEDICAL MEDICALSCIENCES SCIENCES ปีทปี่ี 64 ท่ี 64 ฉบัฉบั บทีบ่ 1ทีมกราคม ่ 1 มกราคม - มี-นมีาคม นาคม 2565 2565 Vol. Vol. 6464 No.No. 1 January 1 January - March - March 2022 2022

วิวิ จจ ัยัย และพั และพั ฒฒ นาเพื นาเพื ่อ่อ ดูดู แลสุ แลสุ ขข ภาพคนไทย ภาพคนไทย

https://bit.ly/BullDmsc https://bit.ly/BullDmsc

ว กรมวิทย พ 64 (1) ม.ค. - มี.ค. 2565 Bull Dept Med Sci 64 (1) January - March 2022

ครบรอบ ครบรอบ80 80ปีปีแห่ แห่งงคุคุณ ณภาพ ภาพ